黃連炭疽病病原鑒定及其對殺菌劑敏感性測定

莫維弟,方 茜,程歡歡,周志成,丁海霞，2*

(1.貴州大學 農學院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省農業科學院/貴州省農業生物技術重點實驗室,貴州 貴陽 550006)

黃連()為毛茛科多年生草本植物，以根莖入藥，具有瀉火、解毒、清熱、燥濕等功效，是我國常見中藥材。重慶市石柱縣是黃連的主產區之一，產量約占我國總產量的60%。隨著黃連產業化和種植面積的增加，黃連病害的發生漸趨加重，其中黃連炭疽病發病率逐年上升。黃連炭疽病主要危害葉片，嚴重時導致全葉枯死，植株萎蔫，嚴重影響黃連的品質和產量。本研究對石柱縣黃連炭疽病病原進行分離和致病性測定，依據病原菌形態學，結合、、-和基因序列構建系統發育樹對比分析，確定病原菌種類，并測定其對殺菌劑的敏感性，以期為黃連炭疽病的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病害調查及癥狀觀察

調查重慶市石柱縣中藥材基地黃連炭疽病的發生和危害情況，記錄發病部位、典型癥狀。剪取黃連植株葉片發病組織，裝于無菌塑料自封袋，帶回實驗室保存備用。

1.2 病原菌的分離與鑒定

..病原菌分離

采用常規組織分離法，切取黃連病葉病健交界處5 mm×5 mm的小塊，經70%乙醇表面消毒1 min和無菌水洗3次后，接種到PDA平板上進行分離純化培養，25 ℃恒溫培養，待組織塊周圍長出菌落后，挑取菌落邊緣進行純化。純化后的菌株做好標記后，置4 ℃冰箱保存備用。

..形態學鑒定

將分離到的菌株接種于PDA平板上，25 ℃恒溫光照培養7 d后，觀察記錄菌落特征、生長速度，孢子形態等。收集無性孢子并用無菌水懸浮，將孢子懸浮液滴加至載玻片上，于25 ℃培養24 h后觀察附著孢的產生。

..分子鑒定

采用真菌DNA提取試劑盒(Biomiga Fungal gDNA Kit)提取供試菌株DNA，選擇引物ITS4/ITS5、GDF1/GDR1、CHS-79F/CHS-345R和ACT512 F/ACT783R分別對、、-1和基因進行PCR擴增。擴增產物用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗，后將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。所得到的核苷酸序列在GenBank進行Blast同源性比較。將、、-和基因序列上傳至GenBank，其對應登錄號分別為MN542218、MN542219、MN54 2220和MN542221。本研究根據Moriwaki和Damm獲得用于構建系統發育樹的菌株及其登錄號 (表1)，并從GenBank中下載參考序列，采用BioEdit軟件處理4個保守基因、、-和組合序列數據，應用自展法(bootstrap)用軟件MEGA 7.0對菌株HL8構建系統進化樹，自展數據為1000次。

表1 用于構建系統進化樹的菌株及GenBank登錄號Tab.1 Strains used for phylogenetic analysis,along with their corresponding GenBank accession numbers

..致病性測定

采用刺傷接種法進行致病性測定。將純化的菌株分別接種于PDA平板上，于25 ℃培養7 d，收集無性孢子并用無菌水懸浮，稀釋至終濃度10個/mL，取1年生健康黃連植株表面消毒后，用無菌接種針在葉片表面進行刺傷，采用噴霧法，將菌株的分子孢子懸浮液噴灑于刺傷處，以不接種的健康黃連作為空白對照，每個處理重復3次。置于溫度25 ℃、相對濕度70%、光周期12 L∶12 D的條件下恒溫培養，觀察并記錄發病情況，并對發病葉片再次進行病菌分離和鑒定。

1.3 殺菌劑敏感性測定

采用菌絲生長速率法，打取直徑5 mm菌餅置于含不同藥劑濃度 (表2)的PDA平板中央，以不添加藥劑的PDA平板作對照。每個處理3次重復，25 ℃培養7d，采用十字交叉法量取菌落直徑，計算抑制率。抑制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。使用Excel和DPS軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

黃連是一種連作草本植物，在第4到第6年收獲。2018-2019年，對重慶市石柱縣約7公頃的黃連田塊進行了調查，發現炭疽病在田間普遍存在，在黃連種植期均能發生。該病害主要危害黃連葉片，田間發病率為10%～100%，產量損失為10%～30%。5-6月雨水多時，發病尤其嚴重。發病前期葉片上產生零星病斑，圓形或橢圓形，產生油漬狀的小點，以后逐漸擴大為褐色病斑，病斑中間灰白色，并著生小黑點(圖1)，后期病斑連成一片，發病嚴重時全葉枯死并引起黃連植株枯萎，嚴重影響黃連品質和產量。

2.2 病原菌分離結果

根據病原菌形態學特征，從3份患病黃連樣本中共分離出2株炭疽菌，形態、分子鑒定結果均一致，經致病性測定均能使黃連葉片發病，將其中1株命名為HL8，用于后續研究。

2.3 病原菌形態學鑒定

如圖2所示，在PDA培養基上25 ℃光照培養，菌落以1.1 cm/d的速度生長，在7 d后，菌落直徑達8 cm。PDA培養基上生長較快，氣生菌絲白色薄絨狀，菌落生長后期可產生黑色分生孢子堆，分生孢子近橢圓形，無隔膜，大小為 (19.35～40.62) μm×(5.32～9.20) μm。附著孢單生，光滑，近梨形或倒梨形，(13.20～16.82) μm×(7.53～9.78)μm。它的菌落形態、分生孢子盤及分生孢子與已報道的博寧炭疽菌 ()形態一致。

表2 5種供試殺菌劑Tab.2 Five fungicides used in the experiment

圖1 黃連炭疽病的癥狀Fig.1 Symptoms of anthracnose on goldthread

注：A-B:菌落形態(正反面)；C:子實體；D:分子孢子；E-F:附著胞。標尺：D-F = 10 μm。圖2 菌株HL8的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of strain HL8

2.4 病原菌分子生物學鑒定

將獲得的供試菌株的、、-和基因序列提交至Genbank，序列登錄號分別為MN542218，MN542219，MN542220和MN542221，并以此構建多基因系統發育樹。如圖3所示，供試菌株HL8與菌株CBS123755聚集于一支，且支持率達96%，能與其他種明顯區分開。將4個基因序列同菌株CBS123755(JQ005153、JQ005240、JQ005501和JQ005327)進行blast，發現、、-和基因的同源性分別為99.42% (512/515核苷酸)、100% (251/251核苷酸)、99.27% (273/275核苷酸)和99.29% (278/280核苷酸)。因此，結合菌株形態學特征和分子生物學鑒定，將病原菌鑒定為博寧炭疽菌 ()。

圖3 基于ITS、GADPH、CHS-1和ACT基因序列構建的菌株HL8的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HL8 based on ITS、GADPH、CHS-1 and ACT concatenated sequences

2.5 致病性測定

如圖4所示，接種后的葉片在25 ℃保濕培養48 h后開始出現癥狀，5 d后呈褐色病斑，對照未發病。從接種發病的葉片中再次分離得到的菌株與原接種菌株相同，表明該菌株為致病菌，可通過傷口侵染。

2.6 殺菌劑敏感性測定

供試的5種殺菌劑對病原菌均有不同程度的抑制作用，其中，異菌脲·氟啶胺和多菌靈抑制效果最好，EC值分別為0.30 μg/mL和0.46 μg/mL；其次為百菌清和精甲霜靈·代森錳鋅，EC值分別為13.27 μg/mL和37.89 μg/mL；再次為嘧菌酯·代森聯，EC值為84.66 μg/mL(表3)。

注：A:發病植株; B:CK,健康植株。圖4 接種第5天發病情況Fig.4 Colletotrichum boninense caused anthracnose symptoms through an artificial infection test at fifth day after inoculation

表3 5種殺菌劑對Colletotrichum boninense的抑制效果Tab.3 Inhibitory effect of five fungicides against Colletotrichum boninense

3 結論與討論

國內外關于黃連的研究主要集中于種質資源和藥用價值，關于病害的研究報道較少，近年來在重慶地區由于規模化種植以及連作障礙，造成黃連病害日益加重，黃連炭疽病就是其中常見的主要病害之一。本研究從重慶石柱黃連種植基地分離典型炭疽病發病黃連植株，經致病性測定、柯赫氏法則驗證、形態學特征及分子生物學鑒定，將菌株HL8鑒定為博寧炭疽菌()。博寧炭疽菌可以危害太子參、油茶、滇黃精等植物，引起葉片壞死、腐爛、葉枯等。本研究首次報道了由博寧炭疽菌()引起的在重慶市石柱縣嚴重發生的黃連炭疽病，與之前報道的引起湖北省恩施市板橋鎮黃連炭疽病的病原菌一致。

目前對該病害的防治措施主要是田間管理和化學藥劑防治。合理密植，增強透光、透風條件，集中深埋或燒毀病殘體等阻斷初侵染源的手段可有效預防黃連炭疽病的發生。肟菌·戊唑醇、苯醚甲環唑和嘧菌酯等常用于防治由博寧炭疽菌 ()引起的植物病害，其EC分別為1.4925 μg/mL、14.7382 μg/mL和6.8886 μg/mL。本研究的殺菌劑室內敏感性測定表明異菌脲·氟啶胺在EC值等于0.30 μg/mL時，抑菌效果最好，且均小于與市場常用防治藥劑的EC值，因此可作為大田藥劑進一步研究。

本研究首次報道黃連炭疽病的病原菌為博寧炭疽菌()，為該病害的識別和防治提供理論基礎和參考意見。