MRI聯合血清miR-204水平對原發性肝癌經皮穿刺射頻消融術后療效及復發的預測價值

姚升娟， 曲靜琦， 曹宇， 郭雅雯， 沈文

原發性肝癌作為一種常見的消化系統腫瘤，嚴重危害人類健康[1]。目前對于肝癌的治療方法，主要包括手術、肝移植和經皮穿刺射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)[2]。雖然根治性手術是治療肝癌最有效的方式，但經手術切除后，患者發生并發癥的概率大大增加。近年來，隨著RFA等新型技術的發展和成熟，已被廣泛應用于肝癌的治療中，除了具有微創、簡便、可重復操作等優勢，其療效和安全性也得到了廣大臨床醫師及患者家屬的認可[3]。然而，也有多項研究表明，不同個體應用RFA治療后的療效和復發情況存在差異[4,5]。因此，早期預測及評估RFA對原發性肝癌患者治療后的療效和復發情況對選擇合適的治療方法及改善患者預后具有重要意義。MRI具有成像序列多、軟組織分辨率高等優點，擴散加權成像可無創性精準測定腫瘤細微結構和活性情況，通過測量表觀擴散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)值，MRI在肝癌診斷等方面具有重要意義[6,7]。但目前關于MRI在預測RFA治療肝癌效果及復發中的研究還較少。此外，微小RNA(micro RNA，miR)因其在細胞增殖、遷移、凋亡等過程中的調控作用，近年來成為眾多學者研究的熱點。最近的研究表明，miR-204在肝癌的發生、發展及預后中起到重要作用，因此可能是肝癌診斷和預后評估的分子標志物[8,9]，然而目前尚未有研究報道血清miR-204在肝癌經RFA治療后療效及復發情況中的預測價值。本研究旨在探討MRI、血清miR-204及兩者聯合在肝癌經RFA治療后療效和復發情況中的預測價值，以期為臨床治療決策的選擇提供參考依據。

材料與方法

1.病例資料

選擇2019年8月-2020年8月于本院行RFA治療的原發性肝癌患者作為研究對象。病例納入標準：①符合《原發性肝癌診療規范(2019年版)》中的診斷標準,確診為原發性肝癌；②合并肝硬化；③腫瘤直徑<3 cm，且肝功能Child-Pugh分級為A或B級；④肝腫瘤數目不超過3個；⑤治療前未接受其他治療方案,臨床及影像學資料完整。病例排除標準：①合并嚴重心、腦、肺、腎疾病；②合并其他部位惡性腫瘤；③患有自身免疫性疾病。最終，本研究納入212例肝癌患者，其中男114例，女98例，平均年齡(58.28±5.38)歲。本研究所有程序均符合赫爾辛基宣言，獲得了醫院倫理委員會的批準(批號：H2019073)。所有研究對象均自愿參與研究，并簽署了知情同意書。

2.研究方法

MRI檢查方法：于RFA術前一周內對研究對象采用西門子3.0T Skyra MRI掃描儀行MRI檢查，先行常規MRI，然后行擴散加權成像，最后行增強掃描。增強掃描對比劑采用釓塞酸二鈉(商品名：普美顯，德國拜耳醫藥)，劑量0.1 mL/kg，流率1 mL/s,經肘前靜脈注入。采用MRI工作站進行定量分析，全容積畫法手動勾畫感興趣區，在軸面圖像病灶連續層面上對病灶邊緣進行手動勾畫，確保包含整個病灶，記錄表觀擴散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)值，共測量5次，取平均值作為病灶ADC值并進行記錄。

圖1 患者,男,56歲,RFA治療后肝癌完全消融(箭)。 圖2 患者,女,42歲,RFA治療后肝癌完全消融(箭)。 圖3 患者,男,48歲,RFA治療后肝癌殘留(箭)。 圖4 患者,男，57歲,RFA治療后肝癌殘留(箭)。

血清miR-204水平測定:RFA術前抽取研究對象外周靜脈血2 mL，然后于4℃、3000轉/min條件下離心10 min，取上層血清，置于-80℃條件下待用。采用定量實時聚合酶聯反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法測定血清中miR-204的相對表達量。由上海云序生物科技有限公司設計并提供引物，miR-204的引物序列如下：miR-204(F)：5′-ACGAAATGACCCATTGACCGT-3′，(R):5'- GAACCTCCAACGGAGAAGCG-3′；內參基因U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應體系包括0.75 μL E×12 TaqMan⑧基因表達檢測液，7.5 μL TaqMan PCR反應混合液，3 μL cDNA模板，再加ddH2O至15 μL。反應條件為：95℃預變性10 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，共循環40次，然后采用熒光定量PCR儀進行定量測定。采用標準曲線法對miR-204的表達水平進行相對定量分析，應用2-ΔΔCT法計算結果并記錄。

3.療效評估及復發判斷標準

于RFA術后1個月再次進行MRI檢查，參照原發性肝癌診療規范對治療效果進行評估，判斷是否完全消融。對于有腫瘤殘留的患者，予以再次射頻消融治療，但不納入隨訪。對完全消融組患者定期進行電話或門診隨訪，截止時間為患者死亡或出院后1年，記錄患者復發情況。

4.統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數數據以頻數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。應用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評估ADC值、血清miR-204及兩者聯合在預測RFA治療后療效和復發中的效能，兩者聯合的計算公式=β常量+ADC值×βADC值+miR-204×βmiR-204。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.不同療效肝癌患者的一般特征比較

經RFA治療后，完全消融患者182例(85.8%，完全消融組)，腫瘤殘留患者30例(14.2%，殘留組，圖1～4)。兩組患者的性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、Child- Pugh分級、RFA前AFP及合并疾病情況比較差異均無統計學意義(P值均>0.05，表1)。

表1 兩組患者的一般特征比較 (例)

2.不同療效肝癌患者的ADC值、血清miR-204水平比較

完全消融組的ADC值為(1.30±0.12)×10-3mm2/s，顯著高于殘留組[(1.14±0.12)×10-3mm2/s]，差異有統計學意義(t=7.091，P<0.001)；完全消融組的血清miR-204相對表達量為(1.43±0.12)，顯著高于殘留組[(1.25±0.10)]，差異有統計學意義(t=7.246，P<0.001)。

3.ADC值、miR-204水平預測RFA術后療效的效能

ADC值預測RFA術后腫瘤殘留的AUC為0.837(95%CI：0.750～0.923)，截斷值為1.16，敏感度為70.0%，特異度為90.7%；血清miR-204預測RFA術后腫瘤殘留的AUC為0.860(95%CI：0.805～0.916)，截斷值為1.38，敏感度為96.7%，特異度為66.5%；ADC值聯合血清miR-204預測RFA術后腫瘤殘留的AUC為0.915(95%CI：0.861～0.970)，截斷值取ADC值=1.20，miR204=1.31，此時敏感度為86.7%，特異度為90.7%(圖5)。

圖5 ADC值、miR-204水平及兩者聯合預測RFA術后療效的ROC曲線。

4.不同復發情況肝癌患者的一般特征比較

對RFA治療后完全消融的182例肝癌患者進行隨訪，期間11例患者失訪，將其剔除。最終32例患者復發(復發組，圖6、7)，復發率為18.7%，139例患者未復發(未復發組)。未復發組與復發組兩組患者的性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、Child- Pugh分級、RFA術前AFP及合并疾病情況比較差異均無統計學意義(P值均>0.05，表2)。

圖6 患者，男，28歲， RFA治療后腫瘤復發(箭)。 圖7 患者，男，57歲，RFA治療后腫瘤復發(箭)。 圖8 ADC值、miR-204水平及兩者聯合預測RFA術后復發的ROC曲線。

表2 兩組患者的一般特征比較 (例)

5.不同復發情況肝癌患者的ADC值、miR-204水平比較

復發組的術前ADC值為(1.21±0.14)×10-3mm2/s，低于未復發組[(1.33±0.13)×10-3mm2/s]，差異有統計學意義(t=5.052，P<0.001)；復發組的血清miR-204相對表達量為(1.29±0.12)，低于未復發組[(1.46±0.14)]，差異有統計學意義(t=6.188，P<0.001)。

6.ADC值、miR-204水平預測RFA術后復發的價值

ADC值預測腫瘤復發的AUC為0.742(95%CI：0.646～0.838)，截斷值為1.22，敏感度為53.1%，特異度為82.0%；血清miR-204預測腫瘤復發的AUC為0.822(95%CI：0.746～0.898)，截斷值為1.34，敏感度為71.9%，特異度為84.2%；ADC值聯合血清miR-204預測腫瘤復發的AUC為0.868(95%CI：0.807～0.929)，截斷值取ADC值=1.22，miR-204=1.42，此時敏感度為81.3%，特異度為79.1%(圖8)。

討 論

RFA是將電極刺入腫瘤中，通過發射頻波，使腫瘤局部溫度升高，從而使癌細胞變性壞死，達到殺死癌細胞的目的[10]。作為臨床非手術治療肝癌的主要方法，RFA具有創傷小、并發癥少等優點[11]。然而，相關研究表明RFA術后部分肝癌患者會出現復發。因此早期評估RFA治療后的療效和預后對選擇治療方式、改善患者預后具有重要意義。MRI檢查在肝癌療效評估中具有重要價值。近年來，大量研究顯示血清分子標志物對肝癌療效和預后評估具有重要意義，miR-204已被證實在肝癌的增殖、轉移和耐藥性中參與調控作用[9,12]。因此本研究探討了MRI聯合血清miR-204在RFA治療原發性肝癌后療效和復發情況中的預測價值。

本研究結果顯示，經RFA治療后，完全消融患者占85.8%，腫瘤殘留患者占14.2%，這與李世興等[13]之前報道的結果類似。對治療有效與無效組的基礎資料進行比較，結果顯示性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、Child- Pugh分級、RFA前AFP及合并疾病情況兩組差異均無統計學意義,這提示可能有其他因素與RFA治療后的療效有關。之前的研究表明腫瘤直徑和腫瘤位置是影響腫瘤預后的重要因素[14]。鄭孝文等[14]的研究結果顯示，當病灶直徑≥3 cm時，可導致病灶殘留率升高，當病灶位于大血管下方時，也可導致病灶殘留率升高。本研究中，殘留組和復發組的腫瘤直徑大于完全消融組和未復發組，雖然完全消融組與殘留組、復發組與未復發組間的差異無統計學意義，但P值均接近0.05(分別為0.055和0.053)；此外，完全消融組與殘留組、復發組與未復發組的的腫瘤部位分布差異均無統計學意義，但P值亦均接近0.05(分別為0.053和0.059)，與以上文獻報道不符，筆者分析可能的原因如下：①本研究是一項前瞻性研究，醫生對處于特殊位置的腫瘤病灶可能更加關注，對特殊部位的腫瘤改進了穿刺操作技術，并且操作更加謹慎，所以可能降低了特殊位置腫瘤的殘留率；②本研究樣本量不夠大，且納入的腫瘤直徑均<3 cm，可能導致一定程度上的統計學偏倚；雖然完全消融組與殘留組、復發組與未復發組的腫瘤直徑、腫瘤部位分布差異均無統計學意義，但P值均接近0.05，說明兩組間還是有明顯差異的。本研究結果顯示，殘留組的ADC值顯著低于完全消融組，這與之前的研究結果一致[15]。擴散加權成像能從分子水平反映組織內水分子的擴散運動，ADC值便是其重要指標。之前的研究表明，經RFA治療后消融區細胞發生不同程度的變性壞死，細胞組織間水分子增多，擴散速率增快，對應擴散圖像上的低信號，ADC值也隨之增大[15]，因此可通過比較腫瘤內部的ADC值分析其內部變化。此外，本研究發現殘留組的血清miR-204水平也顯著低于完全消融組。之前的研究顯示，miR-204對肝癌細胞的生長增殖具有抑制作用，并且可通過靶向NUAK1抑制肝癌耐藥，因此當miR-204水平降低時，可能會導致治療效果較差[16]。本研究結果顯示，ADC值和血清miR-204水平降低可能預示著RFA治療效果不佳,并對這2個指標的預測效能進行了ROC曲線分析;結果顯示，ADC值預測RFA術后腫瘤殘留的特異度較高(90.7%)，但敏感度不佳(70.0%)，血清miR-204預測RFA術后腫瘤殘留的敏感度較高(96.7%)，但特異度有所欠缺(66.5%)，因此，筆者嘗試聯合ADC值與血清miR-204對術后療效進行了評估，結果顯示，兩者聯合預測的敏感度為86.7%，特異度為90.7%，效能較高。因此，ADC值聯合血清miR-204對預測RFA治療肝癌后的療效具有較高價值。

筆者進一步對治療后效果較好的182例患者進行了為期1年的定期隨訪，剔除11例失訪患者后，共有171例患者完成了隨訪,其中32例(18.7%)患者復發，這與孟兆偉等[15]報道的結果類似。本研究結果顯示，復發組的ADC值和血清miR-204均顯著低于未復發組。之前研究發現，ADC值是微血管侵犯的獨立影響因素，在一定程度上ADC值可反映肝癌細胞的侵襲情況，與肝癌復發有關。Yu等[16]的研究顯示，miR-204是一種腫瘤抑制因子，在肝癌的疾病進展和轉移中具有重要調控作用，miR-204表達降低預示著患者預后不良。筆者進一步對ADC值、血清miR-204預測RFA治療后復發的效能進行了評估,結果顯示ADC值聯合血清miR-204預測腫瘤復發的敏感度為81.3%，特異度為79.1%，效能較高。

本研究存在以下局限性：首先，本研究所有的研究對象均來自同一家醫院，因此選擇偏倚不可避免；其次，本研究的樣本量較小，可能會造成一定程度上的統計學偏倚，進而影響模型的要素選擇，因此本研究的結論還需更大樣本量研究的證實；最后，本研究是一項前瞻性研究，研究設計中的盲法至關重要，但是在實施過程中無法嚴格貫徹盲法，因此可能也造成了一定程度上的偏倚。

綜上所述，MRI聯合血清miR-204對原發性肝癌RFA術后療效及復發情況具有一定預測價值，可為臨床治療決策的選擇提供參考依據。