基于FD-GC-O 和OAV 法分析不同處理的黃瓜汁關鍵活性成分差別

譚夢男，潘少香，孟曉萌，劉雪梅，鄭曉冬，吳茂玉，宋 燁，曹 寧，閆新煥

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是葫蘆科一年生蔓生或攀援草本植物，具有美容、抗過敏之效，還有通經、活血、解毒、利尿等生理作用[1-2]。我國黃瓜的總產量占全球總產量的81%，是全球最大的黃瓜生產國。黃瓜作為世界上十大熱量最低的蔬菜之一（16 Kcal/100 g），具有獨特的風味，脆嫩的質地，深受全球各國人民的喜愛。隨著消費水平的提升，人們對產品多樣性及質量要求不斷提高，促進了黃瓜精深加工產業的可持續發展，黃瓜汁產品應運而生。鮮榨黃瓜汁以其清爽的口感、清新的香氣越來越受到人們歡迎，市場占有率越來越大。但黃瓜汁中的香氣成分多為熱敏性物質，受溫度影響較大，在殺菌過程中，加熱處理會導致美拉德等反應，使相關香氣物質發生變化產生異味甚至不良風味，因此目前黃瓜汁仍未實現工業化生產。

氣相色譜-嗅聞技術（GC-O）是將人體感官分析與儀器檢測相結合，從復雜的混合物中篩選和評價氣味活性物質貢獻大小的一種有效方法[3]。目前用于客觀性評價單一香氣組分的感官貢獻大小的GC-O 方法大體分為3 類：稀釋閾值法（dilute to threshold analysis，DTA）、直接強度法（direct intensity analysis，DIA）和頻率檢測法（frequency detection analysis，FDA）[4-5]。與其它兩種方法相比，FDA 方法可以用最少的時間確定化合物香味屬性，分析結果具有較好的重復性，是應用較普遍的一種GC-O 分析方法。依據該方法得出，一種氣味物質的檢測頻率（detection frequency，DF）越大，其香氣貢獻就越大。香氣活性值（OAV）是香氣化合物濃度與閾值的比值，能確切地評價單一香氣成分對整體香氣的貢獻作用，一般認為OAV≥1 的物質對整體香氣的呈現有貢獻作用[6-7]。將GC-O 技術與香氣強度法相結合，可以更快速地篩選出樣品特征香氣化合物，香氣強度越大，對整體香氣的貢獻越大[2]。

本文利用頻率檢測-氣相色譜-嗅聞技術（FD-GC-O）和香氣活性值法（OAV）對鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁的揮發性成分進行分析，鑒定黃瓜汁關鍵活性成分，為優化黃瓜汁加工工藝、提升黃瓜汁品質提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲堤黃瓜，采摘于濟南市濟陽區曲堤街道郭家村蔬菜大棚。

氯化鈉，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；2-辛醇，色譜純，德國Dr.Ehrensorfrt GmbH 公司。

1.2 儀器與設備

數顯恒溫水浴鍋，HH-4，江蘇省金壇市正基儀器有限公司；破碎機，UM5，德國STEPHAN 公司；蒸汽滅菌器，YXQ-LS-100A，上海博迅實業有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀，TRACE 1300-ISQ，美國Thermos 公司；電子天平（精度0.01 g），PL2002，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；20 mL 頂空進樣瓶，HM-2075G，浙江哈邁科技有限公司；50/30μm萃取頭，DVB/CAR/PDMS，美國supelco 公司；嗅聞儀，PALRSI，德國GERSTEL 公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 工藝流程

黃瓜→挑選→清洗→破碎打漿→壓榨→均質→加熱（95 ℃）殺菌→冷卻→成品

1.3.2 操作要點

挑選無病蟲、無腐爛、新鮮的黃瓜，用流動的清水洗凈，放入破碎機中破碎，經紗布過濾，得到黃瓜汁；均質，在95 ℃下殺菌30 s，冷卻后，置于4 ℃下貯藏備用。鮮榨黃瓜汁不經過殺菌處理，以此作為對照。

1.4 樣品前處理

HS-SPME 處理：稱取5.00 g 黃瓜汁樣品于盛有1 g氯化鈉的20 mL 頂空瓶中，并加入32.88 μg/mL 的2-辛醇20 μL 作為內標。將頂空瓶加蓋密封后，放入三位一體自動進樣器上，待測。

1.5 揮發性成分檢測方法

采用GC-O-MS 系統對黃瓜汁揮發性香氣成分進行分析。GC-O-MS 是由氣相色譜、質譜和嗅聞裝置組成。樣品經進樣口解析后，經GC 分離后分別進入質譜檢測器和嗅聞檢測器，分流比為1∶1。嗅聞人員在嗅聞口記錄所聞到的香味特征和保留時間。

1.5.1 自動進樣器條件

選擇SPME 進樣模式，樣品孵化時間5 min，振搖速度 為 450 r/min，孵化溫度為40℃；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 纖維萃取頭（萃取前按照說明進行老化處理）的萃取深度為18 mm，萃取時間35 min，萃取溫度40 ℃，萃取時振搖；進樣深度為35 mm，脫附時間300 s后，進行GC-MS 分析。

1.5.2 GC-MS 分析條件

GC 條件：DB-5MS色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）；采用程序升溫模式，起始溫度為40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min 升溫速率升至180 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min 升溫速率升至250 ℃，保持3 min，進樣口溫度為250 ℃；以氦氣（純度99.999%）為載氣，流速為1.666 mL/min，不分流進樣。

MS 條件：電子轟擊離子源（EI），EI 電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃，GC/MS 傳輸線溫度250 ℃；掃描方式為全掃描，質量掃描范圍50～600 mau。延遲2 min。

嗅聞條件：氣相毛細管柱末端以分流比為1∶1 分別連接質譜和嗅聞儀。氣味輸出通過無涂層填充的色譜柱，色譜柱溫度設定為220 ℃，在嗅聞口處對氣體進行加濕，防止因氣體干燥引起嗅聞人員不適。黃瓜汁中香氣組分的鑒定由10 名嗅聞人員來完成。所有嗅聞人員對GC-O 有一定的實驗基礎，實驗前經過知識培訓、標準品嗅聞、樣品感官和GC-O 上機實驗等培訓等，嗅聞過程中要求嗅聞人員記錄香氣物質出現的時間，并對其香氣屬性進行準確描述。以每種物質被10 名聞香人員所嗅聞到的總次數作為它們的DF，來表征每種物質的香氣貢獻大小。本實驗中，將DF≥5 的物質確定為關鍵香氣成分。

1.5.3 定性與定量

定性方法：通過正構烷烴C5～C20進行揮發性組分的線性保留指數（linear retention index，LRI），并與已發表文獻中的LRI 進行匹配，然后利用GC/MS 工作站軟件Xcalibur 自帶NIST 標準庫自動檢索各組分質譜數據，結合質譜裂解規律確定其化學成分，僅對能予以定性的物質（SI 和RSI 值大于800）進行探討。

定量方法：使用內標法定量，2-辛醇（32.88 μg/mL）為內標，并根據加入內標的含量從而計算樣品中每一個揮發性香氣物質的含量，計算公式見式（1）。

式中，Ci為物質i的含量，mg/kg；cs為內標物s 的濃度，μg/mL；V為加入內標物s 的體積，mL，Ai和AS分別為待測組分i和內標化合物s 的峰面積；m為稱取的黃瓜汁樣品質量，g；Fi為待測組分i對內標s 的相對質量校正因子；本實驗中各待測組分i的相對校正因子均為1[8-9]。

1.5.4 關鍵香氣活性物質分析

在各種揮發性組分定量的基礎上，參考文獻[10]中各物質在水中的香氣閾值，計算該物質的OAV值。OAV為揮發性化合物質量濃度與該物質嗅覺閾值的比值，通常用OAV 表示呈香物質在香氣中起作用的強度，當OAV≥1 時，認為該香氣物質可能對食品香氣的貢獻和影響較大，OAV＜1，則表明該物質對總體香氣無實質性貢獻，一般情況下，OAV 越大則說明該物質對總體香氣的貢獻越大[11]。因此，本研究把OAV≥1 作為黃瓜汁特征香氣成分的判別標準[7]，其計算公式見式（2）。

式中，OAVi表示揮發性成分i的氣味活度值；Wi表示每個揮發性成分的含量，mg/kg；Qi表示揮發性成分i在水中的氣味閾值，mg/kg。

1.6 數據分析

采用Microsoft excel 2019 軟件處理數據并作圖，每組數據平行測定10 次，結果表示為“平均值±標準偏差”的形式。

2 結果與討論

2.1 鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁揮發性成分種類及含量

利用HS/SPME-GC-MS 方法測得鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁的揮發性風味物質，見表1，總離子流圖如圖1（見下頁）所示。共發現22 種化合物，其中醛類物質10 種，醇類物質7 種，酮類物質1 種，酯類物質1種，酸類物質1 種，其他物質2 種。結果表明，黃瓜汁主要香氣成分為能夠賦予黃瓜青鮮氣的不飽和C6、C9的醛、醇。定量結果表明鮮榨黃瓜汁中醇類物質含量高達3.972 6 mg/kg，其中，反-2,順6-壬二烯醇含量最高，而加熱殺菌后的黃瓜汁中醇類物質含量僅為0.206 9 mg/kg；加熱殺菌后的黃瓜汁中醛類物質含量高達3.460 2 mg/kg，其中反-2-,順-6-壬二烯醛含量最高，而鮮榨黃瓜汁中醛類物質含量為0.192 9 mg/kg。鮮榨黃瓜汁中檢出的化合物含量超過0.1 mg/kg 的化合物有乙醇（0.12 mg/kg）、醋酸（0.23 mg/kg）、正己醛（0.11 mg/kg）、正壬醇（0.45 mg/kg）、順式-3-壬烯-1-醇（0.10 mg/kg）、(Z)-6-壬烯-1-醇（1.32 mg/kg）、反-2,順6-壬二烯醇（1.83 mg/kg）。加熱殺菌后的黃瓜汁中含量超過0.1 mg/kg 的化合物為壬醛（0.101 7 mg/kg）、(Z)-壬-2-烯醛（0.67 mg/kg）、反-2-,順-6-壬二烯醛（2.325 2 mg/kg）。這與其他學者的研究結果基本一致。尚明月等[12]報道黃瓜中含有較多的(E)-6-壬烯醛和壬醛，具有獨特的水果香甜風味，其中‘南水8 號’反-2-,順-6-壬二烯醛含量最高，黃瓜風味最為濃郁。王春芳等[13]發現采用反,順-2,6-壬二烯醛和己醛的含量測定進行黃瓜汁的氣味評價是較為可靠的。

圖1 鮮榨黃瓜汁（a）和加熱殺菌后的黃瓜汁（b）總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram diagram of fresh cucumber juice(a) and heated sterilized cucumber juice(b)

表1 鮮榨黃瓜汁與加熱殺菌后黃瓜汁中揮發性組分的定性定量分析Table 1 Qualitative and quantitative analysis results of volatiles in fresh cucumber juice and heated sterilized cucumber juice

2.2 鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁揮發性成分FD-GC-O 與OAV 分析結果

表2 中列出了嗅聞人員采用GC-O 法從黃瓜汁中嗅聞到的活性化合物，共計15 種，以醇類物質和醛類物質居多。黃瓜汁整體嗅香主要表現為青草香的主香，并伴有果香及花香。所有嗅聞人員均嗅聞到的活性化合物（DF=10）為反-2-,順-6-壬二烯醛及反-2-,順-6-壬二烯醇且均被描述為“清香、黃瓜味”。除此之外，鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后黃瓜汁中正己醛、2-己烯醛及反,反-2,4-庚二烯醛均被絕大多數嗅聞人員描述為“青草香”。在鮮榨黃瓜汁中有部分嗅聞人員嗅聞到的活性化合物有(+)-檸檬烯（清香味、檸檬味）、反式-2-已烯-1-醇（生青味）、甲酸庚酯（果香味）。加熱殺菌后黃瓜汁中嗅聞到的活性化合物數量明顯少于鮮榨黃瓜汁，且(+)-檸檬烯（清香味、檸檬味）、反式-2-已烯-1-醇（生青味）、甲酸庚酯（果香味）及醋酸（酸味）物質未被嗅聞到。分析其原因是加熱殺菌使黃瓜汁中一些熱穩定性較差的香氣物質破壞，因而導致殺菌后黃瓜汁中香氣物質種類及數量降低[14]。

表2 鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁揮發性成分FD-GC-O 與OAV 分析結果Table 2 Results of volatile components FD-GC-O and OAV of fresh cucumber juice and cucumber juice after heating sterilization

利用OVA 法從鮮榨黃瓜汁中鑒定出7 種關鍵活性化合物（OAV≥1），分別為正己醛、(+)-檸檬烯、順式-4-庚烯醛、醋酸、壬醛、反-2-,順-6-壬二烯醛及反-2-,順-6-壬二烯醇。其中反-2-,順-6-壬二烯醇OAV 值最高為1 827；從加熱殺菌后黃瓜汁中共鑒定出5 種關鍵活性化合物（OAV≥1），分別為正己醛、順式-4-庚烯醛、壬醛、反-2-,順-6-壬二烯醛及反-2-,順-6-壬二烯醇，其中反-2-,順-6-壬二烯醇加熱殺菌后OAV 值急劇降低至68，而反-2-,順-6-壬二烯醛OAV 值升高至232，說明反-2-,順-6-壬二烯醇加熱殺菌后發生復雜的化學反應，導致其含量急劇降低，推斷發生氧化反應，部分反-2-,順-6-壬二烯醇脫氫生成反-2-,順-6-壬二烯醛。另外加熱殺菌導致醋酸及(+)-檸檬烯OAV＜1，說明加熱殺菌在一定程度上造成香氣損失。一般情況下，DF 值與OAV 值呈對應關系，即DF 值越高，OAV 值越大，該物質的活性越大[5]，對黃瓜汁的整體貢獻也越大，如反-2-,順-6-壬二烯醛及反-2-,順-6-壬二烯醇。但也有特殊情況，如鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁中2-己烯醛雖然OAV＜1，但因與其它物質間存在協同效應，在嗅聞過程中仍被識別到，因此對黃瓜汁香味貢獻大的物質相對含量并不一定大，僅從相對含量來比較不同成分對香味的貢獻是不準確的，需要結合閾值才能得出更真實的結果[15]。

3 結論

根據GC-MS 檢測結果，鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁共發現22 種化合物，其中醛類10 種，醇類7種，酮類1 種，酯類1 種，酸類1 種，其他類別2 種，鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁主要香氣成分為能夠賦予黃瓜青鮮氣的不飽和C6、C9的醛、醇，其中鮮榨黃瓜汁中正己醛、(+)-檸檬烯、壬醛、醋酸、反-2-,順-6-壬二烯醛、反-2-,順-6-壬二烯醇具有較強的香氣活性（OAV≥1）易被大多數人識別（DF≥5）；加熱殺菌后的黃瓜汁中具有較強的香氣活性（OAV≥1）易被大多數人識別（DF≥5）的物質為正己醛、壬醛、反-2-,順-6-壬二烯醛、反-2-,順-6-壬二烯醇。因此正己醛（青草味）、壬醛（花香）、反-2-,順-6-壬二烯醛（黃瓜味）、反-2-,順-6-壬二烯醇（清香、黃瓜味）是黃瓜汁的關鍵活性成分。