基于網絡藥理學及分子對接技術探討五苓散治療慢性心力衰竭的作用機制

樊懿萱，王心意，鞠建慶，陳 卓，張 艷，徐 浩

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多種心臟疾病的終末期階段。由于各種原因造成心臟結構和/或功能變化，心室的收縮和/或舒張功能障礙，從而引起以呼吸困難、勞累疲乏、液體潴留等為主要表現的一組復雜綜合征[1]。至2019年，我國心血管病病人約3.30億人，其中心力衰竭病人約890萬人[2]。目前CHF的藥物治療以利尿劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑為主。但是CHF病程較長，后期發展為多器官、多系統的損害，西藥治療受到一定限制，且長期應用西藥副作用較多[3]，治療效果不佳。CHF屬于中醫學“心衰病”的范疇，根據主要癥狀不同，分屬中醫學“水腫”“痰飲”“虛勞”等范疇。五苓散出自“醫圣”張仲景所著《傷寒論》，原文中8處提及五苓散，以溫陽化氣利水為主。現代研究證實，在CHF基礎用藥上加用五苓散，心力衰竭癥狀明顯緩解，同時降低腦鈉肽(BNP)等心力衰竭實驗室指標水平，提高心臟收縮能力，具有降脂、降壓、利尿等功效，可有效改善心臟功能[4]。網絡藥理學融合了網絡信息學、系統生物學及藥理學相關知識，而研究中藥時又結合了中醫哲學，包括中藥與方劑學的相關知識。中藥復方的研究在網絡信息中量化，通過尋找藥物中多種化合物成分，建立藥物-疾病-靶點網絡，體現了中藥多成分、多靶點、多途徑的特點[5]。分子對接主要運用計算機技術，立足于現代藥理學基礎，驗證網絡藥理學相關結果[6]，同時從分子機制分析中藥復方，為實驗驗證提供參考。本研究借鑒網絡藥理學方法，探討五苓散對CHF作用的相關分子機制，同時運用分子對接方法進行驗證，為五苓散治療CHF提供依據。

1 資料與方法

1.1 藥物與疾病靶點網絡的建立

1.1.1 五苓散藥物靶點篩選 應用中藥系統藥理學技術平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)，分別以“白術”“澤瀉”“豬苓”“茯苓”“桂枝”為關鍵詞檢索五苓散組成藥物的主要成分，根據TCMSP中的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及生物活性分子類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為標準，篩選五苓散組方藥物中符合條件的化合物作為活性成分，同時在TCMSP平臺中篩選出活性成分對應的靶點，將相應靶點輸入UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)、STRING數據庫(https://string-db.org)及DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)。STRING及DrugBank數據庫作為補充，挖掘相應靶點信息。3個數據庫中均選擇物種為“人”(Homo sapiens)，將靶點轉化為相應的靶基因。

1.1.2 疾病靶點篩選 以“chronic heart failure”為關鍵詞，分別檢索GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/drugs)，DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)。總結已有報道的CHF相關靶點基因，GeneCards與DisGeNET數據庫由于提取基因較多，通過Relevance score取二倍中位數篩選與疾病相關度較高的基因靶點，合并所有數據庫，去除重復基因，得到疾病基因庫，作為交集網絡構建的基礎。

1.1.3 五苓散藥物-化合物-靶點網絡構建 建立五苓散藥物-化合物-靶點網絡文件，將五苓散藥物中的活性成分及其對應靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件中，進行可視化處理，通過軟件自帶Analyze Network功能分析網絡，根據自由度(Degree)值篩選出關鍵藥物成分。

1.1.4 尋找藥物與疾病交集靶點并構建韋恩圖 將藥物與疾病靶點導入在線數據分析與可視化網絡平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)，構建交集韋恩圖，得到五苓散與CHF的交集基因。

1.1.5 五苓散藥物成分-交集靶點網絡建立與關鍵化合物選取 將藥物有效成分及交集靶點導入Cytoscape 3.8.0中，構建成分-交集靶點網絡，分析網絡，通過Degree值與中位數篩選五苓散關鍵化合物。

1.1.6 蛋白相互作用網絡構建分析及關鍵靶點篩選 將交集基因導入STRING平臺，選擇物種為Homo sapiens，自動生成蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡。同時將生成的蛋白節點信息以tsv文件導入Cytoscape 3.8.0軟件，通過Analyze Network及CytoNCA插件分析PPI，利用Degree、中心性(closeness)及介數(betweenness)與中位數篩選關鍵靶點。

1.2 基因本體(GO)分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 利用Metascape平臺(http://www.metascape.org/)分析交集基因，導入基因后選擇物種為H.sapiens，通過平臺進行GO及KEGG分析，得到關鍵生物過程(biological processes，BP)、細胞組成(cellular components，CC)、分子功能(molecular functions，MF)及KEGG通路(KEGG pathway)，結果篩選后導入可視化平臺得到GO及KEGG直方圖。

1.3 分子對接 在TCMSP平臺中搜索關鍵化合物結構，保存為mol2文件。陽性對照藥物選擇利尿劑托伐普坦。該藥物通常在CHF病人使用呋塞米等常規利尿劑發生抵抗或者出現腎臟損害時應用[7]。研究發現，在常規藥物和呋塞米基礎上加用五苓散，治療后病人呋塞米用量減少，且利尿劑抵抗發生率明顯降低[8]，故將五苓散與托伐普坦對比。在DrugBank平臺中得到托伐普坦化學結構式，保存為mol2文件，為分子對接做準備。將篩選出的關鍵靶點與KEGG通路富集的基因進行比較，選擇主要靶點；將靶點導入PDB網站(http://www.rcsb.org/)，得到對應的靶點蛋白及PDB編碼(PDB ID)，保存蛋白結構為pdb文件。將mol2及pdb文件導入CB-Dock在線對接平臺(http://cao.labshare.cn/cb-dock/)，平臺基于Autodock vina 1.1.2版本進行在線對接，對接過程相對快速，且成功概率較大。對接結果中得到Vina分數(Vina score)與腔體大小。Vina分數的數值越低，結合能力越強，受體和配體的親和力越好，并且腔體的大小接近或大于配體，對接的準確性就會提高。

2 結 果

2.1 五苓散藥物成分的篩選結果 得到五苓散藥物成分共49個，分別為白術7個、澤瀉9個、豬苓11個、茯苓15個、桂枝7個，去重后共有46個。詳見表1。

表1 五苓散中化合物基本信息

(續表)

2.2 五苓散藥物-活性成分-靶點網絡構建 篩選出對應靶點的五苓散活性成分共30個，對應的靶點去重后共計67個，標準化后得到靶基因共63個。構建藥物-活性成分-靶點網絡圖，圖中共包含95個節點、165條邊，體現了五苓散多成分、多靶點的特點。詳見圖1。

圖1 五苓散藥物-活性成分-靶點網絡(綠色圓形代表藥物名稱；六邊形及菱形代表藥物活性成分；藍色圓形代表藥物對應靶點)

2.3 CHF靶點篩選及交集基因 合并數據庫并去重后得到CHF相關基因共1 529個，將藥物和疾病基因導入在線可視化平臺，得到五苓散與CHF交集靶點共36個。詳見圖2。

圖2 五苓散與疾病交集韋恩圖

2.4 藥物成分-交集靶點網絡構建及關鍵藥物成分篩選 構建藥物成分-交集靶點圖，網絡圖共有63個節點、85條邊，詳見圖3。共計有10個關鍵成分。五苓散5種藥物囊括關鍵活性成分，且桂枝所占比例最多，可見在五苓散治療CHF的過程中，桂枝發揮的治療作用尤為突出。詳見表2。

圖3 藥物成分-交集靶點網絡圖(圓形代表藥物活性成分；菱形代表藥物與疾病交集靶點)

表2 五苓散關鍵藥物成分

2.5 PPI網絡建立及關鍵靶點選取 將交集靶點導入STRING平臺，得到PPI網絡(見圖4)。分析PPI網絡，篩選出排名前10位的關鍵靶點，靶點以NOS3、CASP3、PTGS2、HSP90AA1、CAT等為主，具體靶點詳見表3。

表3 蛋白相互作用網絡分析(前10位基因)

圖4 交集基因PPI網絡圖

2.6 GO分析 GO分析結果富集在BP、CC、MF的分別有576個、32個、54個，分別選取前10位形成直方圖。BP主要集中在血液循環(blood circulation)、循環系統流程(circulatory system process)、細胞對有機循環化合物的反應(cellular response to organic cyclic compound)、循環系統中的血管過程(vascular process in circulatory system)等，以循環系統作用為主，和CHF密切相關；CC富集結果主要與細胞膜相關；MF主要富集于蛋白質均二聚活性(protein homodimerization activity)、蛋白結構域特異性結合(protein domain specific binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、支架蛋白結合(scaffold protein binding)、G蛋白偶聯胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)等多種功能。詳見圖5。

圖5 GO生物過程、細胞組成、分子功能分析直方圖(前10位)

2.7 KEGG富集分析及通路-靶點-藥物成分網絡構建 KEGG信號通路富集中靶點數居前20位的信號通路主要包括：AGE-RAGE信號通路、細胞凋亡、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、液體剪切應力和動脈粥樣硬化、心肌細胞的腎上腺素能信號通路、環磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路、刺激神經組織的中的交互、鈣信號通路、雌激素信號通路、p53信號通路、點樣受體信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路，詳見圖6。每條通路富集多個基因，體現了五苓散多靶點、多通路的特點。

圖6 KEGG通路富集分析(前20位)

2.8 分子對接驗證 最終篩選出NOS3、CASP3、PTGS2、HSP90AA1、CAT、JUN、ESR1、RELA、NR3C1、CASP8共10個靶點。除CASP3沒有對應的表達合適的PDB ID外，其余均有一定對接能力。并且Vina分數與腔體大小基本接近于托伐普坦，化合物與NOS3和PTGS2的結合力較好，詳見表4、表5。可視化分析對接結果，可見靶點蛋白與活性成分對接結構，選擇Vina分數后4位作圖，共有5組對接，同時與托伐普坦比較，詳見圖7。

表4 化合物及托伐普坦與靶點對接的Vina 分數

表5 化合物及托伐普坦與靶點對接的腔體大小

圖7 配體與大分子對接結果可視化分析

3 討 論

CHF的中醫病機以“虛、瘀、水”為基礎，以益氣、養陰、溫陽、活血、利水為主要治則，其中水飲內停的主要選方為五苓散[9]。現代醫學認為心肌重構是CHF發生發展的重要病理生理學過程[1]，心肌細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激是促進心肌重構的主要病理機制[10]。針對五苓散君藥澤瀉的藥理研究，已明確其具有利尿、降低血脂作用，并且可以減少氧化應激中產生的活性氧(ROS)，抵抗氧化損傷，還能通過抑制NF-κB通路起到抗炎作用[11]。含有關鍵化合物最多的桂枝，治療心血管疾病的作用顯著，具有良好的降血壓、擴血管作用，同時也發揮抗炎作用[12]。本研究挖掘獲得五苓散多個活性成分。動物實驗表明，β-谷甾醇可以調節凋亡基因從而抑制心肌細胞凋亡，而二氫槲皮素具有抗氧化作用，通過調節心肌組織中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性，抑制氧化應激，防止心肌缺血損傷[13]。常春藤皂甙元可以降低高脂血癥大鼠的血液黏度[14]，改善血流動力學，降低心血管疾病風險。兒茶素具有抗氧化、抗炎及改善血管內皮障礙的作用[15]，并且兒茶素競爭性抑制磷酸二酯酶，促進鈣離子內流，具有擴張血管、產生正性肌力的作用，改善血流動力學，同時抑制心肌細胞凋亡。與米力農等磷酸二酯酶抑制劑相比，兒茶素屬于天然藥物，對心臟的副作用較小，應用于CHF更加安全[16]。

本研究篩選出NOS3、CASP3、PTGS2、HSP90AA1、CAT、JUN、ESR1、RELA、NR3C1、ICAM1等關鍵靶標，靶標通過相關通路發揮作用。血管中一氧化氮(NO)的釋放，有賴于NOS3的誘導。NO可以幫助血管舒張，防止血小板聚集，阻止血栓的產生，起到了保護血管、防止動脈粥樣硬化的作用[17-18]。通過實驗基本確定調節NOS3可以改善左心室再灌注心肌損傷，有望減輕左心室不良重構[19]。CASP3屬于細胞凋亡相關分子，與心肌細胞凋亡關系密切[20]，抑制CASP3有利于防止細胞凋亡，延緩疾病進展。PTGS2編碼產生環氧合酶-2(COX-2)，抑制COX-2會導致心力衰竭的風險增加[21]。有研究發現，保護HSP90AA1有利于缺血-再灌注后心肌細胞的恢復[22]。CAT可以有效抑制神經內分泌系統激活時導致的氧化應激，過表達時可以抵抗缺血-再灌注導致的心肌損傷[23]。JUN是轉錄因子AP-1的主要組成成分，而AP-1同樣介導細胞的增殖、分化與凋亡[24]。RELA通過翻譯后的泛素化修飾，可以抑制NF-κB炎癥通路[25]。NR3C1為糖皮質激素受體基因，容易變異，有研究發現，該基因的變異與心血管疾病常見的血壓、血脂、血糖等危險因素相關[26]。

GO富集分析發現多生物過程主要富集于循環系統。分子功能主要包括蛋白質均二聚活性、泛素蛋白連接酶結合、類固醇結合、泛素樣蛋白連接酶結合、半胱氨酸型內肽酶活性參與細胞凋亡信號通路，每種功能富集多個基因，說明五苓散相關靶點通過發揮多種分子功能作用于CHF。KEGG分析結果顯示，富集的多條通路與心血管疾病關系密切，每條通路富集多個基因，五苓散通過調控相關通路作用于CHF。AGE-RAGE信號通路可以通過氧化應激反應激活NF-κB通路，引起異常炎癥反應，同時也會引起細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等基因的轉錄，易導致心血管疾病的發生[27]。研究發現，IL-17通過AP-1上調存在于心肌細胞中趨化因子C-C基序配體2(CCL2)的表達，加速了心肌損傷[28]。IL-17激活NF-κB信號通路[29]等多種炎癥通路，促進心肌細胞凋亡[30]。研究表明，TNF-α導致左心室重塑，同時激活炎癥通路，與心肌炎、心力衰竭多種心臟疾病相關[10]，因此，調控TNF相關通路對心力衰竭的治療有一定影響[31]。動物實驗表明，激活cGMP-PKG信號通路可以減輕心肌損傷，抑制炎癥反應[32]。心肌細胞的腎上腺素能信號可以介導鈣信號通路，有效防止心律失常，起到保護心臟的作用[33]。

分子對接結果中，參與對接的主要藥物成分與相關靶標有良好的對接，尤其是谷甾醇(sitosterol)、麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇(ergosta-5，7，22-trien-3-ol)、麥角甾-7，22-二烯-3β-ol(ergosta-7，22-diene-3β-ol)與NOS3和PTGS2的結合力較為顯著，且與陽性對照藥物托伐普坦接近。托伐普坦對CHF液體潴留和利尿劑抵抗有效，并且有臨床試驗表明治療后病人血清TNF-α、ICAM-1等炎癥分子水平降低[34]。因此，本研究結果為五苓散用于CHF利尿劑抵抗病人提供了網絡藥理學依據。

通過網絡藥理學分析五苓散治療CHF的作用機制，體現了五苓散藥物多種成分、多個靶點、多條通路作用于疾病的特點，主要以炎癥通路、氧化應激、心室重構、細胞凋亡等相關通路作用于CHF，研究挖掘出的藥物成分與相關靶點為實驗驗證及新藥的開發提供了基礎。