基于網絡藥理學探討清痰化瘀方治療冠心病痰熱瘀結證的作用機制

楊志華，畢穎斐，毛靜遠，王賢良，李金哲，任曉宇

冠心病是指由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或閉塞導致心肌缺血、缺氧或壞死而引發的心臟病[1-2]。中醫學將冠心病歸屬于“胸痹”“心悸”“水腫”“喘證”等范疇[3]。隨著人們生活方式和飲食結構的改變，血瘀、痰濁等冠心病標實證素較前明顯增多，且常郁而化熱，痰熱瘀結已成為冠心病較常見的中醫證候表現[4]。清痰化瘀方為天津中醫藥大學第一附屬醫院毛靜遠教授臨床治療冠心病痰熱瘀結證的經驗方劑，主要由半夏、瓜蔞(皮)、茯苓、陳皮、丹參、黃連、枳殼組成，方中陳皮、半夏、茯苓是二陳湯的核心藥物組成，具有燥濕化痰、理氣和中的功效，黃連、半夏、瓜蔞(皮)是小陷胸湯的藥物組成，具有清熱化痰、寬胸散結的功效，丹參活血化瘀、通經止痛，枳殼理氣寬中，全方共奏清熱化痰、活血化瘀、理氣寬胸的功效。臨床實踐提示，清痰化瘀方可有效緩解冠心病痰熱瘀結證病人臨床癥狀，提高運動耐量和生活質量。由于中藥及其復方具有多成分特點，這種復雜性使其作用機制難以明確。網絡藥理學是將藥物作用網絡與生物網絡整合在一起，分析藥物在此網絡中與特定節點或模塊的相互作用關系，從而理解藥物和機體相互作用的科學[5]，從整體觀角度認識藥物與疾病間的相互作用[6]。本研究運用網絡藥理學方法對清痰化瘀方治療冠心病的化學成分、作用靶點、生物學過程、信號通路等方面進行分析，旨在揭示清痰化瘀方治療冠心病痰熱瘀結證可能的作用機制，為其臨床合理應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 清痰化瘀方化學成分的篩選 運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，篩選清痰化瘀方中陳皮、半夏、茯苓、黃連、丹參、瓜蔞(皮)、枳殼的活性成分。藥物在人體內要經過吸收、分布、代謝和排泄(ADME)過程才能到達靶器官發揮其治療作用，基于口服生物利用度(orlbioavailability，OB)、類藥性(drug-likeness，DL)是篩選藥物的關鍵參數，以ADME參數中的OB≥30%、DL≥0.18[7-8]為限制條件進行初步篩選，匯總結果，去除重復、刪除沒有相關信息的化學成分，即為清痰化瘀方治療冠心病相關的化學成分。

1.2 清痰化瘀方潛在靶點的收集及網絡構建 根據已篩選的清痰化瘀方中藥的化學成分，通過TCMSP平臺檢索與化學成分相關的潛在靶點，并通過Uniprot數據庫將預測出的靶點名轉換為基因名。將篩選的潛在靶點導入Cytoscape 3.5.1軟件，構建“中藥-化學成分-靶點”網絡圖。

1.3 冠心病相關靶點的篩選 以coronary heart disease為關鍵詞，利用DrugBank、治療靶點數據庫(therapeutic target database，TTD)、DisGeNET、美國國家生物技術信息中心(Center for Biotechnology Information，NCBI)數據庫，篩選與冠心病相關的基因，刪除重復基因，共收集到1 104個與冠心病相關的靶點基因。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡構建 將冠心病靶點與清痰化瘀方靶點進行Venn分析，篩選出二者共同靶點，將共同靶點導入String數據庫，構建PPI網絡模型，將物種設置為“Homo sapiens”，為確保數據的可靠性，蛋白最低相互作用閾值設為“highest confidence”(>0.9)，對蛋白相互作用進行篩選，并將結果導入Cytoscape軟件，分析PPI網絡并對網絡進行渲染。在網絡中，1個節點的度(degree)表示在PPI網絡中與該節點直接相互作用的節點的數目，節點越大則其參與的生物功能越多，其生物學重要性越強。設置節點大小和顏色深度反映度的大小，節點越大、顏色越深，說明節點的自由度越大。

1.5 基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 采用DAVID(Version 6.8，http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)在線分析數據工具對共同靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。以錯誤風險率(FDR)<0.01及P<0.01為篩選條件，取P值最小的前20個生物學過程；以P<0.01為篩選條件，篩選富集最顯著的前20條信號通路，并將通路上的靶點基因以及涉及的化合物、中藥導入Cytoscape 3.5.1軟件，構建“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡，闡明清痰化瘀方治療冠心病的作用機制。其中的節點代表化合物、靶點或疾病，邊代表這些節點之間的相互關系，即某個化學成分與靶點或靶點與疾病之間的聯系。

2 結 果

2.1 清痰化瘀方的化學成分 本研究從TCMSP數據庫篩選清痰化瘀方的化學成分，以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選結果：陳皮5個、半夏13個、茯苓15個、黃連14個、丹參65個、瓜蔞(皮)11個、枳殼5個，刪除重復成分4個，剔除沒有相關信息成分23個，共有101個化學成分。部分化學成分信息詳見表1。

表1 清痰化瘀方部分化學成分基本信息

(續表)

2.2 清痰化瘀方“中藥-化學成分-靶點”網絡構建 通過 Cytoscape 軟件中 network analyzer 插件進行拓撲分析，得到清痰化瘀方“中藥-化學成分-靶點”網絡圖(見圖1)。圖中共包括361節點，其中，7個中藥節點，101個化學成分節點，253個靶點節點和1 501條邊。紅色三角形代表7味中藥的節點，綠色矩形代表靶點節點，櫻桃紅、淡紅色、綠色、黃色、藍色、深藍色、淺綠色菱形分別代表枳殼、陳皮、茯苓、半夏、丹參、瓜蔞(皮)、黃連的化學成分節點，MOL004328和MOL005828是陳皮、枳殼兩味中藥的化學成分，MOL000358、MOL002776分別是半夏和枳殼、半夏和丹參共有的化學成分。分子MOL000098(quercetin)有 141個潛在靶標，其次是MOL007154(tanshinone ⅡA)有39個靶標，MOL000358(beta-sitosterol)有37個靶標、MOL000006(luteolin)有 36個潛在靶標，MOL002174(baicalein)有34個。這些度值較高的藥物分子有可能在清痰化瘀方的藥理功能中發揮相對重要的作用。在253個靶點節點中有142個靶標至少與2個化合物連接，網絡中絕大多數候選化合物與 2 個蛋白質靶點連接，也說明清痰化瘀方中含有的候選化合物分子可能作用于整個生物網絡系統，體現了清痰化瘀方多成分與多靶點之間共同作用的機制，同時也符合中藥復方的特點。

圖1 清痰化瘀方中藥-化學成分-靶點網絡圖

2.3 共同靶點PPI網絡構建 將1 104個冠心病靶點與254個藥物靶點輸入Venny 2.1軟件得到112個共同靶點。將112個共同靶點導入String數據庫進行PPI分析，去除無相互作用的靶點，將結果導入Cytoscape 3.5.1軟件進行拓撲結構分析。該網絡由96個節點、300條邊組成，平均節點長度為6.25，其中，節點的大小由自由度決定，自由度越大，節點越大，節點顏色越深。詳見圖2。

圖2 共同靶點PPI網絡

2.4 “中藥-化學成分-共同靶點-疾病”網絡構建 運用 Cytoscape 軟件構建清痰化瘀方中藥-化學成分-共同靶點-疾病網絡圖(見圖3)，圖中共216個節點，其中7味中藥(紅色節點)，96種化學成分(藍色節點)，112個共同靶點(綠色節點)，1種疾病(黃色節點)。結果顯示，槲皮素(quercetin)、丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)、川陳皮素(nobiletin)、巴馬汀(palmatine)、4-甲亞基丹參新酮(4-methylene miltirone)、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮(2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3,4-dione)、黃連素(berberine)等化學成分度值排名靠前，在整個網絡中發揮重要作用，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關鍵化學成分。

圖3 “中藥-化合成分-共同靶點- 疾病”網絡圖

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析包括分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組分(cellular component，CC)3 個分支。對共同靶點進行GO功能富集分析，得到640個GO功能富集條目，以FDR<0.01及P<0.01為篩選條件，前20個生物學過程見表2。結果顯示，有13個條目與生物過程有關，主要涉及細胞老化、低氧反應、藥物反應、NO生物合成過程正調控、炎癥反應、正調控平滑肌細胞增殖，正調控RNA 聚合酶Ⅱ啟動子等過程；有3個條目與細胞組成有關，涉及細胞內外間隙等過程；有4個條目與分子功能有關，涉及酶結合、類固醇激素受體活性、細胞因子活性等過程。

表2 GO功能富集分析結果

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID對112個共同靶點進行KEGG通路富集分析，共得到108條信號通路，以P<0.01為篩選條件，選取清痰化瘀方治療冠心病相關的前20條信號通路，見表3。并通過ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)對富集分析結果進行可視化處理(見圖 4)。其中，X 軸表示富集因子(rich factor，即背景基因集中這個通路所有基因的數量)，Y 軸代表通路，氣泡大小代表目標基因在這個通路的基因數量，氣泡顏色代表富集顯著性，即P值的大小。

表3 20條信號通路富集分析結果

(續表)

圖4 KEGG 通路富集結果氣泡圖

3 討 論

本研究運用網絡藥理學方法篩選出清痰化瘀方中藥的101個有效成分，同時通過構建“中藥-化學成分-作用靶點”網絡，分析了中藥、化合物、作用靶點之間的相互關系，揭示了清痰化瘀方多成分-多靶點治療機制。本研究發現槲皮素、丹參酮ⅡA、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、川陳皮素、巴馬汀、4-甲亞基丹參新酮、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、黃連素等化學成分在整個網絡中度值較高，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關鍵化學成分。現代藥理研究表明，丹參具有保護心肌、抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、改善微循環、抗凝血及抗血小板聚集、調血脂、降血壓、免疫調節等作用[9]，丹參酮ⅡA和木犀草素是丹參的活性成分，丹參酮ⅡA具有保護心肌細胞、抗凝血、抗血小板聚集、降低高脂血癥大鼠肝臟中的脂質沉積的作用[10-12]；木犀草素可以減輕心肌缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡損害，其機制可能與減少促炎細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α 及白介素-6(IL-6)的產生，進而減輕炎癥反應有關[13]。黃連具有抗炎、降血糖、抗腫瘤、調血脂、抗心律失常等藥理活性[14]，黃連的活性成分槲皮素可通過抗炎、抗氧化、降低血清三酰甘油和總膽固醇以及抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化等作用，降低冠心病的發病風險[15]。半夏和枳殼活性成分中均含有β-谷甾醇，研究表明β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、降血脂、抑制血小板聚集、抗動脈硬化、防治冠心病和高血壓等作用[16-17]。柚皮素、川陳皮素均是陳皮、枳殼的化學成分，柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、清除自由基的作用[18-20]，對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，其保護心肌的機制可能與減輕氧化應激損傷和抑制炎癥反應有關[21]，川陳皮素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等藥理作用[22]。

GO富集分析結果顯示，清痰化瘀方治療冠心病主要涉及細胞增殖與凋亡、炎癥反應、氧化應激、激素分泌、NO合成、物質代謝等生物學過程；有酶、蛋白、細胞因子、受體、轉錄因子、激素等多種物質參與，提示清痰化瘀方治療冠心病是一個十分復雜的生物學過程。通過對112個靶蛋白進行PPI分析發現，TNF、蛋白激酶1(AKT1)、IL-6、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、MAPK8、血管內皮生長因子 A(VEGFA)、原癌基因蛋白(FOS)等靶蛋白度值較大，說明這些靶蛋白在此網絡圖中發揮關鍵作用，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關鍵靶蛋白。例如，TNF-α和IL-6等細胞因子參與機體炎癥反應，并且作為冠心病的獨立危險因素，其表達水平升高可增加心血管疾病的患病風險[23]，血液中TNF-α、IL-6的含量增高可以增加冠心病或者非致死性心肌梗死病人的死亡率[24]。

KEGG通路富集結果顯示，清痰化瘀方治療冠心病的較多靶點被富集在TNF、低氧誘導因子-1(HIF-1)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)、Toll樣受體、環磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)等信號通路上。HIF-1信號通路與炎癥反應關系密切[25]，當機體缺血缺氧時，HIF-1不僅可以促進糖酵解，加強無氧代謝途徑，使細胞在缺氧條件下獲得足夠的能量，維持細胞生存[26]，而且能夠促進炎癥中新血管生成[27]；此外，HIF-1可與缺血、缺氧下高表達的 P53 結合，增加其穩定性，而 P53 是缺氧條件下誘導炎癥細胞凋亡的重要參與因子，加快炎癥細胞凋亡的發生[28]；HIF-1 還可誘導促紅細胞生成素(EPO)、轉鐵蛋白、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等促紅細胞生成因子的表達，加快氧的運輸，提高氧的利用能力[29]，心肌細胞缺血缺氧時，可以通過調控HIF-1信號通路，促進血管新生，增加心肌血供，對保護心肌具有重要意義[30]。現有的研究結果證明，cGMP-PKG信號通路對于調控心血管系統的正常功能起著重要的作用，在調節血壓、抑制動脈粥樣硬化和抗再狹窄、抗血管損傷、調節血管平滑肌細胞的收縮和舒張、抑制心肌細胞肥大等方面發揮重要作用[31-32]。PKG通路激活能夠通過引起血管舒張、抑制內皮細胞通透性以及對心肌細胞的負性肌力作用而保護心血管系統[33]。PI3K-Akt 信號通路在冠心病的發生發展過程中發揮著重要作用，研究發現PI3K-Akt 信號通路可通過調節血管平滑肌細胞增殖、遷移及細胞凋亡等影響動脈粥樣硬化病變的發生發展[34]。韓軍等[35]發現金絲桃苷激活可通過激活PI3K-Akt 信號通路，改善心室肌收縮與舒張功能，清除氧自由基，減少心肌酶釋放，減輕炎癥反應，上調 Bcl-2 蛋白表達，下調 Bax 蛋白表達，抑制細胞凋亡對大鼠心肌缺血再灌注損傷產生保護作用。

本研究運用網絡藥理學方法，對清痰化瘀方治療冠心病的化學成分、關鍵靶點、生物過程及通路進行了初步探討。結果顯示，清痰化瘀方中的槲皮素、丹參酮ⅡA、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、川陳皮素、巴馬汀、4-甲亞基丹參新酮、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、黃連素等有效化學成分，可能通過作用于TNF、AKT1、IL-6、MAPK3、MAPK8、VEGFA、FOS等關鍵靶點，調節PI3K-Akt、cGMP-PKG、TNF、HIF-1、Toll樣受體等多條信號通路治療冠心病。但本研究僅基于系統數據進行初步分析，存在一定的局限性，清痰化瘀方治療冠心病的具體作用機制仍需要開展實驗進一步驗證。