間斷寒邪暴露對ApoE-/-動脈粥樣硬化模型小鼠血脂代謝及單核巨噬細胞表達的影響

耿運玲，吳圣賢，何小娟，李 立，樊丹采，石英杰，舒海洋，蘇文全，王子卓，杜雅薇

流行病學表明，冬季心腦血管疾病頻發，當戶外溫度低于18 ℃，溫度每下降1 ℃，心腦血管疾病的死亡率會隨之增加[1]。眾所周知，心腦血管疾病主要病理基礎是動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性代謝疾病，許多學者已經展開對動脈粥樣硬化危險因素的研究，其研究的焦點包括脂質代謝紊亂及炎癥相關病理變化過程。

近年來，已有很多關于冬季對動脈粥樣硬化造成心血管事件的研究，有研究發現，持續寒邪暴露可以促進解偶聯蛋白 1(uncoupling protein 1，UCP1)依賴性皮下脂肪組織的脂解，繼而出現血脂異常，加快動脈粥樣硬化斑塊增生和不穩定，從而導致心血管事件增加[2]。而其后有研究結論與之相反[3]，但后者與本課題組前期研究發現的持續寒邪暴露不能加重動脈粥樣硬化斑塊的結論[4]一致。自然界的冬季及戶外溫度更傾向于間斷寒邪暴露模型。Wang等[5-6]研究表明，間斷寒邪暴露更有利于新陳代謝，且隨著社會文明的進步，現代社會的人類很少長期直接暴露于室外極端環境中[7]，間斷寒邪暴露模式更貼合于人類生活真實環境。臨床研究數據顯示，在間斷寒邪暴露的環境下，人體在不影響體質量的情況下，棕色脂肪組織富集，進而減脂[8]。而相反，有研究表明，間斷寒邪暴露可以在不影響體質量的情況下，促進皮下脂肪堆積[9]，并促進動脈粥樣硬化的增生和不穩定性[10]。間斷寒邪暴露對于動脈粥樣硬化病人屬于有益條件或有害條件，目前尚不明確。

因而研究間斷寒邪暴露對動脈粥樣硬化小鼠的血脂代謝及炎癥的影響，可以進一步評估自然環境中心腦血管疾病風險。本研究采用間斷寒邪暴露處理高脂飲食誘導的載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)動脈粥樣硬化模型小鼠，觀察小鼠進食量、體質量、血脂水平及脂肪組織中單核巨噬細胞M1、M2表型占比及M1/M2比值，為預防臨床上冬季心腦血管頻發事件提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10～12周齡的ApoE-/-小鼠36只，SPF級，雄性，體質量(29±2)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006；動物使用許可證號：SYXK(京)2017-0033。

1.2 主要試劑與儀器 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)粉末(pH 7.3)，貨號：ZLI-9062，購自中杉金橋公司；PE anti-mouse CD206(貨號141706)、FITC anti-mouse F4/80(貨號123107)、APC anti-mouse CD11c(貨號117310)及PE Ctrl(貨號400508)、FITC Ctrl(貨號400506)、APC Ctrl(貨號400912)均購于Biolegend公司；戊巴比妥鈉(貨號：TOP0263，Biotoppd公司)；D-Hank′s平衡鹽溶液(HBSS，編號：Gibco14175)；膠原酶Ⅰ型(Gibco17100)；牛血清白蛋白(BSA)購自北京索萊寶科技有限公司。

動物飼養恒溫箱(北京福意聯公司)；精準天平(上海儀器儀表廠)；流式細胞儀(型號：Accuri C6，美國BD公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；顯微鏡(型號DP72，日本Olympus公司)。

1.3 分組與造模方法 將36只ApoE-/-小鼠按照隨機數字表法分為常溫對照組和間斷寒邪暴露組，每組18只，均飼養于北京中醫藥大學東直門醫院屏障動物實驗室，室溫保持在22～24 ℃，相對濕度50%，12 h交替光照。兩組小鼠均采用基礎飼料于常溫適應性飼養3 d，自由飲食水。3 d后各組小鼠均接受高脂飲食喂養(配方為78.85%基礎飼料+0.15%膽固醇+21%脂肪，經60Coγ照射滅菌處理，購自北京華阜康生物科技股份有限公司)，共 16 周，其中后 8 周間斷寒邪暴露組小鼠進行每天6 h間斷冷刺激。

間斷寒邪暴露組小鼠造模方法參照文獻[6]，小鼠于每日 08：30～09：00進行間斷冷刺激，將小鼠置于 4 ℃動物飼養恒溫箱，每天連續 6 h進行冷暴露，剩余 18 h置于20～22 ℃環境，共8周。本研究通過北京中醫藥大學東直門醫院動物倫理委員會批準，并在嚴格規范的操作下進行。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 進食量及體質量 每周一、周四15：00左右記錄每只小鼠的體質量、進食量，并觀察小鼠體型的變化。

1.4.2 脂肪組織重量 用戊巴比妥鈉以60 mg/kg注射麻醉小鼠(稱重0.15 g戊巴比妥鈉晶體加入50 mL蒸餾水配成0.3%的戊巴比妥鈉)，每只小鼠0.8～1.0 mL。摘眼球取血后脫脊處死小鼠，取出小鼠肩胛、腹股溝、附睪部位脂肪組織，并分別稱重記錄。

1.4.3 血脂 間斷寒邪暴露處理8周后，采用生化法檢測小鼠血漿中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.4.4 單核巨噬細胞M1、M2 采用流式細胞術檢測單核巨噬細胞M1、M2的占比，并計算M1/M2比值。用F4/80+標記單核巨噬細胞，在此基礎上，CD11c+CD206-標記單核巨噬細胞M1表型，CD11c-CD206+標記單核巨噬細胞M2表型。

流式細胞術方案參照文獻[11]。①配制消解液(7.5% BSA 3 mL+HBSS溶液7 mL+0.02 g膠原酶)，稱取0.1 g膠原酶放入干凈燒杯中，加入7.5% BSA溶液15 mL、HBSS溶液35 mL，放入磁力攪拌子，將溫度調整為36.5 ℃、轉速調整為150 r/min，攪拌1 h后用保鮮膜封口，錫箔紙避光，過夜后用0.22 μm濾膜過濾除菌。②消解脂肪組織：取脂肪組織后放在PBS中洗去血液，剪碎后放入15 mL錐形離心管中，加入脂肪組織體積1∶1的消解液于37 ℃恒溫水浴箱中消解60 min，直到沒有可見的塊狀物。③分離巨噬細胞：消解后，將離心管置于冰上，讓脂肪細胞和脂質(浮在頂部)與基質血管成分(SVF)分離，在SVF中可以找到巨噬細胞。用移液管清除脂肪細胞和脂質。其余的水相將進一步使用。使用100 μm過濾器過濾的水相SVF細胞，除去團塊。在4 ℃下，以1 500 r/min轉速離心10 min。清洗兩遍，取出上清液，將SVF顆粒重懸于1%BSA的PBS緩沖液1 mL中進行流式細胞分析。④流式細胞分析：調整細胞至100 μL中含5×105個細胞。細胞濃度可通過血細胞計數器測定。在室溫下1 500 r/min離心5 min，去除上清液，用FITC anti-mouse F4/80抗體(Fc阻斷劑，1∶200)1 h，防止非特異性抗體結合。在室溫下1 500 r/min離心5 min；分別用PE anti-mouse CD206抗體、APC anti-mouse CD11c抗體和相應的同型對照對細胞進行緩沖和染色。避光孵育細胞20 min，離心后移除抗體，PBS清洗2次，用200 μL含1%BSA的PBS溶液重懸后將細胞轉移至流式管后上機檢測。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。定量資料先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，若符合正態分布且方差齊，則采用獨立樣本t檢驗，否則使用非參數秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組小鼠進食量及體質量比較 間斷寒邪暴露組小鼠進食量較常溫對照組多，但差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖1；兩組小鼠體質量均隨著飼養周期不斷增加，詳見圖2；間斷寒邪暴露處理3周內，間斷寒邪暴露組體質量較常溫對照組增加，但差異無統計學意義(P>0.05)，間斷寒邪暴露組小鼠冷處理第16周體質量較常溫對照組降低(P<0.05)，詳見表1。

圖1 兩組小鼠第1周～第16周平均進食量變化

圖2 兩組小鼠第1周～第16周平均體質量變化

表1 兩組小鼠第1周～第16周體質量比較(±s) 單位：g

2.2 兩組小鼠脂肪組織重量比較 兩組小鼠肩胛間區棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織、附睪白色脂肪組織重量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 兩組小鼠脂肪組織重量比較(±s) 單位：g

2.3 兩組小鼠血脂比較 與常溫對照組相比，間斷寒邪暴露組小鼠血液中TG降低(P<0.05)，兩組TC、HDL-C、LDL-C比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 兩組小鼠血脂比較(±s) 單位：mmol/L

2.4 兩組小鼠脂肪細胞中單核巨噬細胞M1、M2表達比較 與常溫對照組相比，間斷寒邪暴露組肩胛間區棕色脂肪組織中單核巨噬細胞M1型占比降低，M2型占比升高，但差異均無統計學意義(P>0.05)，M1/M2明顯降低(P<0.01)；腹股溝白色脂肪組織及附睪白色脂肪組織中單核巨噬細胞M1表型占比降低，M2型占比升高，M1/M2降低，但差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖3～圖5及表4～表6。

圖3 流式細胞儀檢測肩胛間區棕色脂肪組織中單核巨噬細胞M1、M2表達

圖4 流式細胞儀檢測腹股溝白色脂肪組織中單核巨噬細胞M1、M2表達

圖5 流式細胞儀檢測附睪白色脂肪組織中單核巨噬細胞M1、M2表達

表4 兩組肩胛間區棕色脂肪組織中巨噬細胞M1、M2占比及M1/M2比較(±s)

表5 兩組腹股溝白色脂肪組織中巨噬細胞M1、M2占比及M1/M2比較(±s)

表6 兩組附睪白色脂肪組織中巨噬細胞M1、M2占比及M1/M2比較(±s)

3 討 論

中醫關于寒與寒邪有很多論述，作為“風寒暑濕燥火”六氣之一的寒，是為了完成萬物的“閉藏”，正如《傷寒雜病論》中云：“冬時嚴寒，萬類深藏，君子固密，則不傷于寒”。又如徐春甫《古今醫統大全》中云：“夫春溫夏熱秋涼冬寒者，四時之正氣也，以成生長收藏之用”。人類可“動作以避寒”，寒冷太過，則生“寒邪”，歸于“六淫”[12]。寒邪致病，不唯冬季，《徐大椿醫學全集》：“寒為肅殺之氣……認為中寒不拘冬夏，或外中天地之寒，或內受飲食之冷，緣元氣內虛，膚腠空豁，寒邪直中三陰之經”。本課題組曾提出，寒邪作用于人體生理狀態下可以出現“寒極生熱、熱氣生清”，病理狀態下，出現“寒氣生濁”[13]。課題組進一步提出“寒生濁氣”[14]的概念，認為寒邪影響人體氣機，可表現為實驗室檢查指標異常，包括血脂代謝紊亂。

臨床研究發現，越來越多的肥胖病人、代謝綜合征及糖尿病病人，常伴有以TG濃度升高為特征的血脂異常。富含TG的脂蛋白顆粒可能導致動脈粥樣硬化事件的殘留風險[15]。對動脈粥樣硬化心血管疾病合并高TG血癥病人，控制TG水平可以降低不良心血管事件發生率[16-17]，在LDL-C控制達標時，心血管疾病的風險仍然較高，而TG作為心血管疾病的獨立危險因素，降低TG水平將可能降低部分心血管疾病殘余風險[18-19]。前期研究發現，C57BL/6J小鼠在持續寒邪暴露狀態下，小鼠血漿中TC、TG、LDL-C明顯下降；ApoE-/-小鼠在持續寒邪暴露狀態下，小鼠TG仍明顯下降，而LDL-C和TC明顯升高[4，20]，并且長期持續寒邪暴露并不能加重動脈粥樣硬化，這并不能解釋冬季心腦血管事件頻發這一現象。本課題組認為自然環境下的冷暴露為間斷寒邪暴露，這和持續寒邪暴露有很大的不同。本研究發現，間斷寒邪暴露處理后，在TC、LDL-C、HDL-C差異不明顯時，小鼠血漿中TG仍然降低了15.68%。表明間斷寒邪暴露對于動脈粥樣硬化TG可能有較好的影響，其與心血管疾病的關系有待進一步探討。

多項臨床研究證實炎癥機制在動脈粥樣硬化的形成中至關重要[21-22]，其病理生理過程大體包括[23]：內皮細胞發生炎癥；單核細胞及白細胞進入粥樣硬化區；趨化因子和趨化蛋白參與炎癥，細胞進一步進入內膜；單核細胞變成組織巨噬細胞，內化脂蛋白顆粒，產生泡沫細胞；泡沫細胞分泌炎性細胞因子、活性氧等介質；巨噬細胞凋亡，形成成熟斑塊的脂質或壞死核心；吞噬細胞放大局部炎癥反應；斑塊纖維帽受損破裂，血栓形成進入血液。基于此過程，炎癥將作為降低心血管疾病的部分殘余風險的另一靶點[24]。抗炎治療可以降低動脈粥樣硬化血栓形成的風險。

肥胖與脂肪組織中慢性炎癥密切相關，而單核巨噬細胞在脂肪炎癥中尤為重要[20]。小鼠脂肪組織中巨噬細胞表型至少有兩種，一種是促炎的M1表型，一種是抗炎的M2表型。M1型巨噬細胞產生促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)；M2型巨噬細胞是抗炎巨噬細胞，其主要表達參與組織修復或重塑的CD206、精氨酸酶-1、白細胞介素-10(IL-10)。F4/80是脂肪組織中單核巨噬細胞的標記物，CD11c[25]是公認的脂肪細胞中巨噬細胞M1型的標記物，CD206為M2型標記物，即F4/80+CD11c+CD206-標記巨噬細胞M1型，用F4/80+CD11c-CD206+標記巨噬細胞M2型[26]。在高脂飲食誘導的肥胖狀態下，小鼠脂肪中巨噬細胞表型由抗炎巨噬細胞M2型向促炎巨噬細胞M1型轉化[27-28]。研究小鼠體質量及脂肪組織中巨噬細胞表型的變化可以了解小鼠脂肪組織的代謝性炎癥狀態。本研究結果顯示，間斷寒邪暴露后小鼠體質量降低，肩胛棕色脂肪組織中M1/M2明顯降低，表明間斷寒邪暴露可以減輕肩胛部位脂肪組織的炎癥狀態，間斷寒邪暴露有減輕高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化小鼠皮下脂肪組織炎癥狀態趨勢。這一結果與先前實驗結果[29]并不一致，可能與造模的模型及造模方式不同有關。

本研究還發現，間斷寒邪暴露后小鼠皮下脂肪組織并未堆積，這一結果與先前間斷寒邪暴露促使小鼠皮下脂肪堆積的研究[9]并不一致，究其原因，可能與間斷寒邪暴露干預時間及干預對象不同，本研究是從動脈粥樣硬化模型造模成功后開始干預，而動脈粥樣硬化模型更適宜研究冬季對動脈粥樣硬化的影響。

綜上所述，高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化小鼠，在間斷寒邪暴露狀態下，小鼠體質量較常溫對照組降低，TG降低，肩胛間區棕色脂肪組織中單核巨噬細胞M1/M2明顯降低。說明間斷寒邪暴露可以降低動脈粥樣硬化小鼠TG，減輕小鼠肩胛部位脂肪組織炎癥狀態。這一結論與冬季心腦血管事件頻發的流行病學調查結果[30]不一致，說明間斷寒邪暴露并不能很好地解釋冬季心腦血管事件頻發這一問題，仍需進一步展開研究。