清肝化痰方對H型高血壓大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平及頸動脈結構的影響

蔣文波，黃 霞，金 玉，陳 昊，季海剛，徐俊偉，顧 寧

高血壓是心血管疾病發生的一種主要危險因素[1]。H型高血壓是伴血同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高(血Hcy水平≥15 μmol/L)的高血壓疾病[2]。炎癥通常引發系列生物反應事件，稱為急性期反應，其主要由早期反應細胞因子的介導產生。實際上，Hcy通過從血管內皮細胞如白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細胞因子的釋放進而誘導血管炎癥[3]。有研究報道，在肝部炎癥反應加重的小鼠模型中，施藥后可降低模型小鼠炎性因子表達水平，改善肝組織炎癥反應等[4]。

清肝化痰方是江蘇省名中醫顧寧教授的臨床經驗方，主要功效為清肝瀉火、健脾化痰，適用于治療高血壓肝火亢盛夾痰證。方藥組成：冬桑葉10 g，白蒺藜10 g，姜半夏10 g，蒸陳皮10 g，決明子10 g，杭白菊15 g，白茯苓15 g，淡竹茹10 g，炒枳殼10 g，谷精草15 g，炙甘草5 g。清肝化痰方中的冬桑葉、白蒺藜、決明子、杭白菊為君藥，清肝瀉火；姜半夏、白茯苓、廣陳皮、淡竹茹、炒枳殼為臣藥，健脾化痰；谷精草為佐藥，疏散肝熱；炙甘草為使藥，調和諸藥。本研究旨在探討清肝化痰方對H型高血壓大鼠平均動脈壓、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平和頸動脈結構的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)雄性30只，鼠齡為9周，體質量200～220 g；SPF級同源正常血壓大鼠(Wistar Kyoto rats，WKY)雄性10只，鼠齡9周，體質量(230±10)g。所有大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 實驗藥品 DL-蛋氨酸粉末購自美國Sigma公司，大鼠飼料購自北京科澳協力飼料有限公司，Hcy試劑盒購自美國BG公司，馬來酸依那普利葉酸片(依葉)購自深圳奧薩制藥有限公司(批準文號：國藥準字H20103723)，清肝化痰方采用天江藥業生產的中藥配方顆粒。

1.1.3 實驗試劑 2%蛋氨酸水溶液：DL-蛋氨酸粉末2 g，加雙蒸水定容至100 mL；10%水合氯醛溶液：水合氯醛粉末10 g，加雙蒸水定容100 mL。

1.2 構建H型高血壓大鼠模型

1.2.1 動物模型制備 選用雄性SHR大鼠30只，適應性喂養1周后，給予2%蛋氨酸溶液10 mL/100 g體質量作為飲用水，連續4周后檢測大鼠血漿中Hcy水平，若血漿Hcy≥15 μmol/L，則符合H型高血壓大鼠模型的構建標準。

1.2.2 血漿Hcy測定 先連續喂養4周，遵循0.3 mL/100 g體質量的10%水合氯醛，腹腔注射麻醉。采集1 mL血依次注射于含有EDTA抗凝劑的試管中，再以3 000 r/min轉速離心15 min，收集上層血漿，全自動生化分析儀Cabas 8000檢查Hcy濃度。

1.2.3 造模結果 實驗選用SHR、WKY大鼠均無死亡發生。SHR大鼠造模后，若查血Hcy≥15 μmol/L，即符合H型高血壓大鼠模型的構建標準，提示造模成功[5]。

1.3 實驗分組 采用隨機數字表法將符合H型高血壓模型的30只SHR大鼠隨機分為模型組、依葉組、清肝化痰方組，每組10只。模型組：正常飼養8周。依葉組：正常飼養，加0.06%依那普利葉酸按10 mL/100 g灌胃，每日1次，連續干預8周。清肝化痰方組：在H型高血壓大鼠模型構建基礎上，正常飼養，同時給予清肝化痰方灌胃，將清肝化痰方顆粒加水200 mL煎煮10 min，剩余藥液不足200 mL者加蒸餾水至200 mL備用，按成人體質量200 mL/60 kg(0.003 mL/g)濃度，2倍濃度灌胃，每日1次，連續干預8周。另設對照組：健康飼養的同源正常血壓WKY雄性大鼠10只，給予雙蒸水作為飲用水，不進行飼料添加處理，按正常飼養標準進行喂養。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 檢測大鼠平均動脈壓 為了減少測量血壓期間實驗動物的精神壓力，本研究采用Muromachi尾套血壓測量儀器(非侵入式)用于本實驗。每周使用無創的智能血壓計鼠儀BP-2010A檢測各組大鼠的收縮壓、舒張壓。實驗當天，在08：00～09：00時，將大鼠稱重后再將動脈插管連接到壓力傳感器上，記錄基礎脈動血壓30 min，每只記錄3次，取其平均數值作為測量的血壓值。計算大鼠白天的平均動脈壓，平均動脈壓=(收縮壓+2×舒張壓)/3。

1.4.2 免疫組化測量大鼠頸動脈中膜厚度(CMT)、頸動脈內徑(CAID)、頸動脈中膜橫截面面積(CAMT) 將大鼠麻醉后固定在手術臺上，頸部去毛后進行切口，取出頸動脈后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗干凈，然后將這些片段充分浸沒在10%中性甲醛溶液中固定過夜，用切片機將樣品切成5 μm厚度的組織切片。測量每條頸動脈上的特定區域(從分叉開始)，并進行蘇木精-伊紅(HE)染色，拍照，各組大鼠頸動脈切片編號并放進盒子里。在Nikon Eclipse TE 2000-U顯微鏡上使用40倍放大率讀取載玻片，通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件采集圖像，測定分析各組大鼠的CMT、CAID、CAMT。

1.4.3 蛋白免疫印跡法分析大鼠主動脈中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達情況 采用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)提取4組大鼠主動脈中的總細胞蛋白質。在SDS-11%聚丙烯酰胺凝膠上分離含有30 μg總蛋白質的樣品，將100 μL的細胞裂解液和1%苯甲基磺酰氟(PMSF)100 mmol/L和原釩酸鈉100 mmol/L加入到每個孔中，在冰上保持15 min。使用12%凝膠通過SDS-PAGE分離30 μg每種蛋白質裂解物，然后將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用5%脫脂乳[5%牛血清白蛋白(BSA)封閉用于檢測磷酸化抗體]封閉非特異性相互作用2 h。用識別大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6(1∶500)的原代兔抗體探測硝酸纖維素，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)綴合的二抗(稀釋比為1∶5 000)、New h-肌動蛋白作為內標，ChemiDocTM MP成像系統收集圖像，Image Lab軟件通過光密度測定法定量免疫印跡上的條帶，并統計灰度值進行分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠平均動脈壓、舒張壓及收縮壓比較 藥物干預第8周時，模型組、依葉組、清肝化痰方組平均動脈壓、舒張壓、收縮壓均較對照組明顯升高(P<0.05)，清肝化痰方組、依葉組平均動脈壓、舒張壓、收縮壓均較模型組降低(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方組平均動脈壓、舒張壓、收縮壓均較依葉組明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠實驗第8周平均動脈壓、舒張壓及收縮壓比較(±s) 單位：mmHg

2.2 HE染色檢測大鼠血管纖維化 藥物干預第8周時，通過HE染色檢測大鼠血管纖維化，結果顯示：模型組較對照組血管纖維化程度明顯增加，依葉組和清肝化痰方組較模型組血管纖維化程度明顯降低；其中，與依葉組比較，清肝化痰方組血管纖維化程度明顯降低。詳見圖1。

圖1 各組大鼠血管纖維化HE染色結果(×400)

2.3 各組大鼠頸動脈CMT、CAID及CAMT比較 藥物干預第8周時，顯微鏡觀察并測量各組大鼠頸動脈CMT、CAID、CAMT，結果顯示：模型組CMT、CAMT較對照組明顯升高(P<0.05)，清肝化痰方組、依葉組CMT、CAMT較模型組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方組CMT、CAMT較依葉組明顯降低(P<0.05)。模型組CAID較對照組明顯降低(P<0.05)，清肝化痰方組、依葉組CAID較模型組明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方組CAID較依葉組明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠頸動脈CMT、CAID及CAMT比較(±s)

2.4 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達水平比較 藥物干預第8周時，采用蛋白免疫印跡技術分析各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達水平，結果顯示：模型組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平較對照組升高(P<0.05)，依葉組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平較模型組降低(P<0.05)，清肝化痰方組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平較模型組明顯降低(P<0.01)。詳見圖2、圖3。

圖2 蛋白免疫印跡檢測各組炎性因子表達

與對照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。圖3 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達水平比較(A為IL-1β；B為IL-6；C為TNF-α)

3 討 論

高Hcy誘導的動脈通透性增加可能涉及由細胞因子TNF-α產生的氧化應激。TNF-α是一種促炎細胞因子，可以提高內皮細胞和血管平滑肌細胞氧負離子[6-7]。Hcy可能促進內皮功能障礙，這可能與氧化應激有關，可導致血管系統中促炎途徑的激活[8]。實驗第8周測量各組大鼠的平均動脈壓、舒張壓、收縮壓，模型組、依葉組較對照組明顯升高，依那普利葉酸、清肝化痰方組較模型組降低，其中，清肝化痰方組較模型組降低更明顯。H型高血壓病人表現出血管內皮細胞的破壞，血管結構發生變化[9-11]。Hcy誘導的H型高血壓大鼠模型中，模型組CMT、CAMT較對照組升高，模型組CAID較對照組降低，說明模型組大鼠的頸動脈結構發生了異常變形；而依葉組和清肝化痰方組CMT、CAID及CAMT均較模型組改善，其中清肝化痰方組改善較為明顯。

TNF-α是組織炎癥的中樞介質之一，誘導其他炎性細胞因子的合成，而IL-6水平升高與心肌梗死風險增加密切相關[12]。Hcy通過從血管內皮細胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α釋放炎性細胞因子誘導血管炎癥等[13-14]。與對照組相比，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達均明顯升高，清肝化痰方組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平均較模型組降低。Hcy能夠誘導主動脈內皮細胞中促炎細胞因子IL-1β和單核細胞趨化蛋白-1的mRNA和蛋白表達[15-16]，因為Hcy和炎癥參數似乎與血管疾病的發生有關[17]。研究表明H型高血壓大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達水平明顯升高，可能造成頸動脈中膜厚度增加、頸動脈內徑減小、頸動脈中膜橫截面面積增大。清肝化痰方通過降低H型高血壓大鼠的平均動脈壓、收縮壓、舒張壓及TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達水平，降低血管纖維化，從而很大程度上改善頸動脈異常變形，為中醫藥治療H型高血壓提供了一定客觀證據。