氟伐他汀調(diào)控Sirt3對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖凋亡的影響

張承中，尹占海，李存寬，王成龍

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中的多能干細(xì)胞，具有強(qiáng)大分化潛能[1]，已用于多種疾病的治療。如BMSCs可分化為神經(jīng)細(xì)胞，用于治療阿爾茨海默病[2]；BMSCs還用于相關(guān)骨疾病的治療[3]。尋找有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的方法對(duì)治療相關(guān)疾病具有重要意義。氟伐他汀是臨床上常用的降血脂類藥物，氟伐他汀可改善骨質(zhì)疏松大鼠骨組織的骨生物力學(xué)性能和形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)氟伐他汀可抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，遷移和細(xì)胞外基質(zhì)積累[5]。氟伐他汀可抑制T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。Sirtuin-3（Sirt3）是sirtuin蛋白脫乙酰酶家族的重要成員之一，沉默Sirt3通過干擾脂肪來源的人間充質(zhì)干細(xì)胞的線粒體功能而導(dǎo)致成脂分化和胰島素抵抗受損[7]。有研究發(fā)現(xiàn)Sirt3可以減少過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)自2019年1―8月研究氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖凋亡的影響，探尋其機(jī)制是否與Sirt3有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司；氟伐他汀購自北京諾華制藥有限公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京碧云天生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒購自日本同仁研究所。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離培養(yǎng) 取2只清潔級(jí)4周齡SD大鼠（購自上海凱學(xué)生物科技有限公司），將SD大鼠麻醉處死，用75%乙醇浸泡15 min后在超凈工作臺(tái)中取大鼠雙側(cè)股骨，PBS反復(fù)沖洗干凈，用含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將沖洗出的髓狀物接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液一次，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)融合度在80%左右時(shí)進(jìn)行消化傳代，取3代后細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本研究中對(duì)于大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 細(xì)胞處理和分組 實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、三個(gè)干預(yù)組、干預(yù)組2+si-NC、干預(yù)組2+si-Sirt3；將BMSCs用400 μmol/L的過氧化氫培養(yǎng)6 h作為模型組；將BMSCs用400 μmol/L的過氧化氫培養(yǎng)的同時(shí)分別加入0.01、0.1、1 μmol/L氟伐他汀作為三個(gè)干預(yù)組；未添加任何物質(zhì)正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為正常組；將si-NC、si-Sirt3轉(zhuǎn)染至BMSCs中再用400 μmol/L的過氧化氫、0.1 μmol/L氟伐他汀處理作為干預(yù)組2+si-NC組、干預(yù)組2+si-Sirt3組。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡（Western Blotting）法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF上，封閉1 h后分別加入Cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、Sirt3一抗（1∶1 000），4 ℃過夜；再加入二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h；顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h后加入150 μL的DMSO，振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，按照試劑盒說明書，分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，孵育后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)資料主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，以±s表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析+多重比較HSD-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞增殖的影響與正常組相比，模型組細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表達(dá)水平、細(xì)胞存活率顯著降低，P21表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，氟伐他汀三個(gè)干預(yù)組Cyclin D1表達(dá)水平、細(xì)胞存活率顯著升高，P21表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。見圖1，表1。

圖1 增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

表1 氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖的影響/±s

表1 氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖的影響/±s

注：Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，P21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A。①與正常組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 9 Cyclin D1 0.78±0.08 0.14±0.01①0.25±0.02②0.48±0.05②0.46±0.04②241.78 0.000組別正常組模型組干預(yù)組1干預(yù)組2干預(yù)組3 F值P值P21 0.22±0.02 0.84±0.08①0.60±0.06②0.43±0.04②0.40±0.03②191.74 0.000存活率/%100.40±10.23 41.57±4.32①50.03±5.08②79.72±8.00②76.42±7.48②96.84 0.000

2.2 氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞凋亡的影響與正常組相比，模型組Bax表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，氟伐他汀三個(gè)干預(yù)組Bax達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。見圖2，表2。

圖2 氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響

表2 氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）凋亡的影響/±s

表2 氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）凋亡的影響/±s

注：①與正常組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

分組正常組模型組干預(yù)組1干預(yù)組2干預(yù)組3 F值P值凋亡率/%8.28±0.92 38.57±4.04①32.05±3.25②16.17±1.83②17.06±1.75②211.22 0.000重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 9 Bax 0.17±0.02 0.79±0.08①0.62±0.06②0.35±0.04②0.33±0.03②229.03 0.000 Bcl-2 0.91±0.09 0.23±0.02①0.36±0.03②0.59±0.06②0.60±0.06②175.18 0.000

2.3 氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞中Sirt3表達(dá)的影響與正常組相比，模型組Sirt3表達(dá)水平顯著降低[（0.31±0.03）比（1.01±0.10），P<0.05]；與模型組相比，氟伐他汀干預(yù)組2中Sirt3表達(dá)水平顯著升高[（0.68±0.07）比（0.31±0.03），P<0.05]。見圖3。

圖3 Sirt3蛋白的表達(dá)

2.4 抑制Sirt3能逆轉(zhuǎn)氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞增殖的作用與干預(yù)組2+si-NC組相比，干預(yù)組2+si-Sirt3組中Sirt3、Cyclin D1表達(dá)水平、細(xì)胞存活率顯著降低，P21表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。見圖4，表3。

圖4 Sirt3和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3 抑制Sirt3能逆轉(zhuǎn)氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖的影響/±s

表3 抑制Sirt3能逆轉(zhuǎn)氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖的影響/±s

組別干預(yù)組2+si-NC干預(yù)組2+si-Sirt3 t值P值重復(fù)次數(shù)9 9 Sirt3 0.70±0.07 0.36±0.04 12.652 0.000 Cyclin D1 0.50±0.05 0.25±0.02 13.927 0.000 P21 0.40±0.04 0.72±0.07 11.907 0.000存活率/%80.19±8.07 47.29±4.82 10.498 0.000

2.5 抑制Sirt3能逆轉(zhuǎn)氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞凋亡的作用與干預(yù)組2+si-NC組相比，干預(yù)組2+si-Sirt3組中Bax表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。見圖5，表4。

圖5 抑制Sirt3能逆轉(zhuǎn)氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響：A為細(xì)胞凋亡圖；B為凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表4 抑制Sirt3能逆轉(zhuǎn)氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）凋亡的影響/±s

表4 抑制Sirt3能逆轉(zhuǎn)氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）凋亡的影響/±s

注：Bax為Bcl相關(guān)X，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2。

組別凋亡率/%重復(fù)次數(shù)Bax Bcl-2干預(yù)組2+si-NC9 0.33±0.030.57±0.0615.96±2.00干預(yù)組2+si-Sirt390.70±0.070.28±0.0333.17±3.46 t值14.5812.9712.92 P值0.0000.0000.000

3 討論

BMSCs能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，其因體外擴(kuò)增繁殖能力強(qiáng)而被廣泛用于治療骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等骨損傷[9]。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可影響B(tài)MSCs的活性，因此提高BMSCs的抗氧化應(yīng)激能力有利于其移植治療成功[10]。本實(shí)驗(yàn)用過氧化氫處理BMSCs，結(jié)果顯示細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高。表明過氧化氫可以抑制BMSCs增殖，誘導(dǎo)BMSCs凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可促進(jìn)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[11]。氟伐他汀可以增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的骨保護(hù)素水平并改善疾病活動(dòng)性變量[12]。氟伐他汀還能減少活性氧的產(chǎn)生，減少脂多糖誘導(dǎo)的體內(nèi)破骨細(xì)胞生成和骨侵蝕[13]。說明氟伐他汀具有抗氧化能力和保護(hù)骨損傷的功能。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的氟伐他汀處理過氧化氫作用的BMSCs，結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，表明不同濃度的氟伐他汀均可促進(jìn)BMSCs增殖，抑制過氧化氫作用的BMSCs凋亡。提示氟伐他汀具有保護(hù)BMSCs使其免受損傷的作用。

Sirt3具有抗氧化作用[14]，有研究發(fā)現(xiàn)老年人間充質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞中Sirt3的減少增加了細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性[15]。過表達(dá)Sirt3可降低氧化應(yīng)激水平并增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的壽命和分化能力[16]。Sirt3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和分化[17-18]。表明Sirt3促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過氧化氫作用的BMSCs中Sirt3表達(dá)水平降低，氟伐他汀處理后Sirt3表達(dá)水平升高，抑制Sirt3表達(dá)逆轉(zhuǎn)了氟伐他汀對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。提示，氟伐他汀可能通過調(diào)控Sirt3影響過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs的增殖和凋亡。

綜上所述，氟伐他汀能抑制過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與上調(diào)Sirt3有關(guān)。將可為減輕BMSCs氧化應(yīng)激，提高其移植治療成功率提供理論參考和依據(jù)。