波形蛋白、骨橋蛋白在三陰性乳腺癌>組織中的表達情況及其與預后的關系▲

郭彬彬 郭 滿 張子杰 張 浩

(河南省南陽市中心醫院1 乳腺外科，2 甲狀腺外科，3 病理科，南陽市 473000，電子郵箱：2550767113@qq.com)

乳腺癌是發展中國家女性發病率最高的癌癥，也是女性癌癥相關死亡的主要原因[1],其發病率逐年增長且發病人群趨于年輕化[2]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)約占所有乳腺癌的10.0%～17.0%。與非三陰性乳腺癌相比，TNBC的發病人群更趨于年輕化[3]，且更具侵襲性，易發生內臟轉移，因雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體-2的表達缺失，對內分泌治療及特異性靶向治療不敏感[4]，預后較差。波形蛋白是一種重要的細胞骨架蛋白，是中間纖維蛋白家族中最重要的一員[5]，與腫瘤的增殖、侵襲、轉移及預后相關[6]。骨橋蛋白是一種多功能分泌型磷酸糖蛋白，在轉移癌和具有高轉移潛能的腫瘤中呈高表達[7-8]。截至目前，國內外對波形蛋白、骨橋蛋白的共同研究較少，兩者在TNBC的發生和發展中的作用機制尚不清楚。本研究檢測波形蛋白、骨橋蛋白在TNBC中的表達情況，分析兩者與TNBC臨床病理特征及預后的相關性，探討兩者在TNBC復發、轉移中作用的可能機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至2015年12月南陽市中心醫院收治的120例TNBC患者為研究對象(TNBC組)。納入標準：均經病理確診為TNBC，既往未接受過抗腫瘤治療。排除標準：雙側乳癌，合并臟器功能障礙，炎性乳腺癌，其他部位惡性腫瘤，生存資料不完善的病例。120例TNBC患者年齡 28～76(51.86±9.07)歲；腫瘤直徑：T0～T1期 49 例，T2期 70例，T3期1例；存在淋巴結轉移48例，無淋巴結轉移72例；原發腫瘤-區域淋巴結-遠處轉移分期：Ⅰ期31 例，Ⅱ期65例，Ⅲ期24例。另選取同期收治的30例乳腺良性疾病患者作為對照組。納入標準：術后經病理確診為乳腺良性疾病，包括乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥。排除標準：合并乳腺癌或其他部位惡性腫瘤。30例乳腺良性疾病患者年齡 30～67(48.70±9.50)歲，其中乳腺增生癥11例，乳腺纖維腺瘤19例。兩組年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經南陽市中心醫院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測波形蛋白、骨橋蛋白的表達情況 采用免疫組化法檢測波形蛋白、骨橋蛋白在TNBC腫瘤組織及乳腺良性疾病組織中的表達情況。將石蠟包埋的TNBC組織及乳腺良性疾病組織連續切成3 μm切片，將切片放入60℃恒溫箱中烘烤2 h，然后使用二甲苯浸泡15 min，更換新鮮二甲苯后再浸泡15 min，遞減梯度乙醇(無水乙醇、體積分數95%乙醇、體積分數75%乙醇、三蒸水)脫去二甲苯并水化，枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)高壓抗原修復，滴加體積分數為3%的過氧化氫溶液室溫孵育20 min；磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)沖洗，滴加即用型一抗(兔抗人骨橋蛋白單克隆抗體工作液100 μL、兔抗人波形蛋白多克隆抗體工作液100 μL)，置于濕盒中室溫孵育2 h，PBS沖洗3次，3 s/次，室溫下滴加二抗(酶標羊抗鼠/兔聚合物)，二氨基聯苯胺顯色，蒸餾水沖洗3次，3 s/次，蘇木精復染，蒸餾水沖洗返藍，遞減梯度乙醇(無水乙醇、體積分數95%乙醇、體積分數75%乙醇、三蒸水)脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察著色情況。以PBS代替一抗進行上述步驟作為TNBC組與對照組的陰性對照。

1.3 結果判定 以胞質中出現棕色或棕黃色顆粒為陽性細胞。按半定量積分法判斷波形蛋白、骨橋蛋白表達情況，根據染色強度及陽性細胞所占比例計分：無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞所占比例<15%計0分，陽性細胞所占比例為15%～25%計1分，陽性細胞所占比例為 26%～50%計2分，陽性細胞所占比例為51%～75%計3分，陽性細胞所占比例>75%計4分。將染色強度和陽性細胞所占比例評分相加，總分<4分為陰性表達，≥4分為陽性表達。

1.4 隨訪方法 隨訪方式采用電話隨訪和門診復診，隨訪截至2019年3月，或患者出現復發、轉移及死亡則隨訪終止，平均隨訪時間55個月，無失訪病例。

1.5 統計學分析 采用 SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用 Spearman秩相關分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線；生存情況的比較采用log-rank檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TNBC組患者與對照組患者波形蛋白、骨橋蛋白表達情況的比較 鏡下觀察可見波形蛋白在TNBC組織中大量表達，而在乳腺良性疾病組織中少量表達，見圖1。TNBC組波形蛋白的陽性表達率為25.00%(30/120)，高于對照組的陽性表達率6.67%(2/30)(χ2=4.807，P=0.028)。鏡下觀察可見骨橋蛋白在TNBC組織中大量表達，而在乳腺良性疾病組織中少量表達，見圖2。TNBC組骨橋蛋白的陽性表達率為26.67%(32/120)，高于對照組的陽性表達率3.33%(1/30)(χ2=7.615，P=0.006)。

圖1 波形蛋白的表達情況(免疫組化，×200)

圖2 骨橋蛋白的表達情況(免疫組化，×200)

(A：TNBC組；B：對照組)

2.2 波形蛋白、骨橋蛋白表達陽性和表達陰性的TNBC患者臨床病理特征的比較 波形蛋白陽性表達患者腫瘤直徑為T2或T3期，淋巴結轉移為N2或N3，臨床分期為Ⅲ期的比例均高于波形蛋白陰性表達患者(均P<0.05)；不同年齡、絕經狀態在波形蛋白陽性表達患者與陰性表達患者之間的分布差異均無統計學意義(均P>0.05)。骨橋蛋白陽性表達患者腫瘤直徑為T2期，臨床分期為Ⅱ期或Ⅲ期的比例均高于骨橋蛋白陰性表達患者(均P<0.05)；不同年齡、淋巴結轉移情況、絕經狀態在骨橋蛋白陽性表達患者與陰性表達患者之間的分布差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 波形蛋白、骨橋蛋白表達陽性和表達陰性的TNBC患者臨床病理特征的比較[n(%)]

2.3 TNBC患者波形蛋白、骨橋蛋白表達情況的相關性分析 Spearman秩相關分析結果顯示，TNBC患者波形蛋白與骨橋蛋白的表達情況呈正相關性(rs=0.392，P<0.001)。

2.4 TNBC患者波形蛋白、骨橋蛋白表達情況與預后的關系 120例TNBC患者隨訪11～74個月，中位隨訪時間為62.8個月，復發、轉移10例，死亡25例。截至隨訪終止時間，波形蛋白陽性表達TNBC患者的無病生存率為 40.0%，低于波形蛋白陰性表達TNBC患者的81.1%(χ2=18.407，P<0.001)，見圖3。骨橋蛋白陽性表達TNBC患者的無病生存率為 59.4%，低于骨橋蛋白陰性表達TNBC患者的 75.0%(χ2=4.492，P=0.042)，見圖4。

圖3 波形蛋白陽性表達TNBC患者和波形蛋白陰性表達TNBC患者的生存曲線

圖4 骨橋蛋白陽性表達TNBC患者和骨橋蛋白陰性表達TNBC患者的生存曲線

3 討 論

乳腺癌已經躍居女性惡性腫瘤發病率第一位[9]。相比較于其他類型乳腺癌，TNBC的組織學分級和侵襲性更高，TNBC內臟轉移的發生率多于骨轉移，易發生脊髄、腦膜、腦、肝和肺轉移，5年生存率遠低于其他類型乳腺癌[10]。因不表達雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體-2，TNBC缺乏有效的內分泌治療及精準的靶向治療，僅僅依賴細胞毒性化療藥物來延緩復發與進展[11]，TNBC是目前治療最棘手的乳腺癌亞型之一，尋找更有效的靶向治療位點及預后預測分子也是亟須攻克的難題。

波形蛋白是中間纖維蛋白，作為間葉分化的標志物，是細胞發生上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的重要標志物，EMT與腫瘤細胞侵襲、遠處轉移相關[5]。波形蛋白在宮頸癌、肺癌，結直腸癌等多種上皮源性腫瘤組織中的表達明顯增高[12]。本研究結果顯示，TNBC組波形蛋白的陽性表達率高于對照組(P<0.05)，與趙俊軍[13]等的研究結果一致。波形蛋白陽性表達患者腫瘤直徑為T2或T3期，淋巴結轉移為N2或N3，臨床分期為Ⅲ期的比例均高于波形蛋白陰性表達患者(均P<0.05)，表明波形蛋白的表達可能與TNBC腫瘤直徑、淋巴結轉移情況、臨床分期有關，波形蛋白可能在TNBC發生和發展發揮重要作用，參與TNBC的增殖、轉移，與TNBC的不良生物學行為密切相關。長期隨訪發現，波形蛋白陽性表達TNBC患者的無病生存率遠低于波形蛋白陰性表達患者(P<0.05)，這提示波形蛋白陽性表達TNBC患者的預后較差，在臨床工作中可通過檢測波形蛋白的表達，對患者預后進行預測，為輔助化療方案的選擇及其他臨床決策提供參考。

目前發現骨橋蛋白對腫瘤的增殖、侵襲、自噬、凋亡及血管新生等都具有重要的調節作用[14-15]。郭滿等[16]分別觀察不同乳腺組織中骨橋蛋白表達的差異，結果表明在TNBC組織中骨橋蛋白的陽性表達率遠高于乳腺增生組織和正常乳腺組織。抑制骨橋蛋白表達可促進TNBC細胞自噬和凋亡，從而抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移[16-17]。本研究結果顯示，骨橋蛋白在TNBC組織中高表達且骨橋蛋白陽性表達患者腫瘤直徑為T2期，臨床分期為Ⅱ期或Ⅲ期的比例均高于骨橋蛋白陰性表達患者(均P<0.05)，這表明骨橋蛋白可能與TNBC腫瘤直徑和臨床分期有關(均P<0.05)，提示骨橋蛋白可能參與TNBC的發生發展。波形蛋白與骨橋蛋白的表達呈正相關(P<0.05)，這表明波形蛋白與骨橋蛋白或許在TNBC的發生和發展中存在調控關系，或許可通過調控例如p38蛋白激酶信號通路表達[17]，進而調控波形蛋白與骨橋蛋白的表達，來實現抑制腫瘤細胞的遷移和轉移。經長期隨訪發現，骨橋蛋白與TNBC預后密切相關，骨橋蛋白陽性表達TNBC患者無病生存率低于骨橋蛋白陰性表達患者(P<0.05)。在臨床工作中可檢測TNBC患者的骨橋蛋白表達情況，對于骨橋蛋白表達較高的患者，應給予相應的臨床重視。

綜上所述，波形蛋白與骨橋蛋白在TNBC組織中陽性表達率高，且兩者表達情況呈正相關，其在TNBC的發生、發展中可能起協同作用，二者的高表達提示TNBC患者預后不良，在臨床上檢測二者的表達水平或可評估患者預后，為TNBC的治療提供臨床指導。