KAT2A通過Survivin乙酰化抑制Wnt/β-catenin通路調控食管癌的機制

梁宗英，楊 陽，孫光蕊，鄭競雄，趙寶山，侯繼申

食管癌是全球范圍內男性癌癥相關死亡的第六大原因，其高侵襲性及高復發率致使患者總生存質量差[1]。Survivin在凋亡抑制蛋白家族中抗凋亡能力最強，廣泛表達于多種惡性腫瘤中[2]。Survivin可以通過復雜的機制調節腫瘤細胞周期和凋亡通路，促進腫瘤細胞增殖，加速腫瘤進展，從而導致患者預后不良[3]。KAT2A是GCN5相關乙酰轉移酶家族(GCN5-related nacetyltrans-ferases family, GNAT)的成員，可以與乙酰輔酶A(CoA)結合并將乙酰基轉移到組蛋白上，進而改變蛋白的功能[4]。文獻報道KAT2A在鼻咽癌、急性髓系白血病及胃癌的癌變和進展過程中發揮關鍵作用[5]。然而，關于KAT2A作為乙酰基轉移酶對食管癌病變中相關蛋白乙酰化修飾的潛在作用尚未見報道。因此，本文觀察下調KAT2A對食管癌細胞內Survivin乙酰化及細胞功能的影響，探討KAT2A與Survivin乙酰化的內在聯系以及在食管癌增殖及遷移中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織和細胞收集2019年1月～2021年1月承德醫學院附屬醫院胸外科食管鱗狀細胞癌45例，用癌組織作為實驗組，正常食管黏膜組織(距癌組織邊緣大于8 cm)為對照組。患者均無其他腫瘤史，術前未行放、化療。45例患者中，男性41例，女性4例；≥60歲38例，<60歲7例；TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期34例，Ⅲ期6例；分化程度：低分化7例，中分化30例，高分化8例；有淋巴結轉移5例，無淋巴結轉移40例。食管癌EC109細胞和正常食管黏膜上皮HEEC細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院。本實驗經承德醫學院附屬醫院倫理委員會批準通過。

1.2 材料培養基、血清、胰蛋白酶消化液、Matrigel基質膠購自上海紀寧公司。凝膠電泳試劑盒及細胞裂解液等購自上海通蔚公司。Alexa Fluor 488-conjugated羊抗兔熒光抗體、ATTO 594-conjugated羊抗鼠熒光抗體購自河北貝博公司。KAT2A、Survivin、Acetylated-Lys抗體、wnt3α、β-catenin和c-myc單克隆抗體、A/G瓊脂糖珠購自Abcam公司。RNA干擾序列由上海生物工程公司設計合成。

1.3 方法

1.3.1免疫組化法 組織脫蠟、破膜、修復抗原；血清室溫封閉；清洗后加入一抗；次日加二抗。采用免疫組化SP法染色，DBA顯色，蘇木精復染。免疫組化判斷標準：根據細胞膜、胞質染色程度和陽性細胞百分率進行評分，每張切片高倍鏡下隨機觀察10個視野。(1)根據細胞染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)根據陽性細胞百分率評分：陽性細胞<10%為1分，10%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項得分相加作為最終評分：0～2分為陰性，3～7分為陽性。

1.3.2生物信息學分析和預測 生物信息學軟件乙酰化集富集法軟件(Acetylation Set Enrichment Based, ASEB)預測可以將Survivin蛋白作為底物催化其發生乙酰化的乙酰基轉移酶[6]。ASEB不僅可以預測目的蛋白的乙酰化狀態，還可以預測催化目的蛋白發生乙酰化修飾的乙酰基轉移酶及可能發生乙酰化的賴氨酸位點。

1.3.3免疫熒光法 組織切片經二甲苯及乙醇脫蠟，PBS清洗后抗原修復；5%血清室溫封閉；加一抗(Survivin抗體1 ∶1 000，KAT2A抗體1 ∶1 000)，4 ℃過夜，37 ℃復溫45 min，PBS洗3次；加熒光標記的二抗；DAPI染色10 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅封片劑封固，拍照。

1.3.4細胞培養、分組及轉染 以轉染siRNA KAT2A細胞為實驗組(si-K)，轉染無siRNA細胞為陰性對照組(si-N)，正常細胞為空白對照組(NC)。食管癌細胞懸液計數，接種到6孔板中，常規培養。用30 μL 1×riboFECT CP Buffer(V1)稀釋1.25 μL 20 μmol/L siRNA儲存液(V2)，輕輕混勻，室溫孵育5 min；加入3 μL riboFECT CP Reagent(V3)，混勻后孵育；將riboFECT CP混合液加入到465.75 μL細胞培養基(V4)中，使總體積達500 μL，混勻；繼續培養48 h后以熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效果。

1.3.5RT-qPCR實驗 提取RNA，反轉錄試劑盒反轉錄。熒光定量試劑盒檢測mRNA的表達；PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45s，合計30個循環。溶解曲線參照儀器自動程序。

1.3.6Western blot實驗 蛋白測定濃度，制備電泳蛋白上樣液，行凝膠電泳。電泳后，轉膜。加一抗4 ℃過夜。次日孵育二抗，重復洗膜后顯影。

1.3.7免疫共沉淀實驗 蛋白測定濃度，加入5 μL目的蛋白純抗體和5 mL A/G瓊脂糖珠，混勻后2×裂解緩沖液補充至總體積450 μL，離心后，取400 μL上清液置入離心管，4 ℃、15 r/min共沉淀12 h。4 ℃離心，棄上清液。1×裂解緩沖液500 μL洗滌A/G瓊脂糖珠。離心3 min，棄上清液。重復洗滌3次；最后一次洗滌完畢后，棄去上清液。1×裂解緩沖液35 μL和等體積的2×SDS上樣緩沖液混合，煮沸后離心；下一步行Western blot實驗。

1.3.8細胞功能學實驗 (1)MTT實驗：細胞計數后接種于96孔板。常規培養后轉染。分別于12、24、48、72 h時間點各拿出一塊板，加入MTT液30 μL，繼續常規孵育4 h。加入二甲基亞砜，80 r/min搖勻5～10 min，待結晶消失后用酶標儀測定570 nm處的細胞吸光度值(OD值)。(2)劃痕修復實驗：細胞接種于96孔板。無菌移液槍頭劃痕，繼續培養，分別于劃痕后24、48、72 h觀察細胞生長狀態，并在倒置顯微鏡下測量劃痕寬度。(3)Transwell小室侵襲實驗：Matrigel稀釋液包濾膜，過夜聚合成膠。小室滅菌后抽去殘余的膠液，培養液濕化1 h。備轉染后單細胞懸液。Transwell小室放入24孔板，取出小室，室外加培養基600 μL。小室內加200 μL細胞懸液，每組細胞重復6個樣本。培養48 h后取出小室，PBS淋洗，擦去微孔膜內層細胞。多聚甲醛固定后結晶紫染色。顯微鏡下計數穿膜細胞數。

2 結果

2.1 食管癌和正常食管黏膜組織中Survivin乙酰化水平癌組織中Survivin蛋白乙酰化率為(66.48±3.14)%，高于正常食管黏膜組織的(17.31±2.42)%，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 食管癌和正常食管黏膜組織中Survivin蛋白乙酰化水平

2.2 食管癌和正常食管黏膜組織中Survivin和KAT2A蛋白表達量免疫組化檢測顯示：癌組織和正常食管黏膜組織中Survivin蛋白陽性率分別為71.11%(32/45)和28.89%(13/45)，KAT2A蛋白陽性率分別為75.56%(34/45)和24.44%(11/45)，差異均有統計學意義(P<0.05，圖2)。Western blot結果顯示：Survivin在癌組織中表達為(74.35±3.43)%，高于正常食管黏膜組織(22.62±2.48)%；KAT2A在癌組織中表達為(70.68±3.15)%，高于正常食管黏膜組織的(23.87±2.67)%，差異均有統計學意義(P<0.05，圖3)。

癌組織正常組織SurvivinKAT2A

2.3 乙酰基轉移酶KAT2A以Survivin為底物催化其發生乙酰化的預測生物信息學軟件ASEB預測結果顯示：乙酰基轉移酶KAT2A可以將Survivin作為底物催化其發生乙酰化，其可能發生乙酰化的賴氨酸(K)為121和349號位點(P<0.05，表1)。

圖3 Western blot法檢測食管癌及正常食管黏膜組織中Survivin和KAT2A蛋白表達

表1 乙酰基轉移酶KAT2A以Survivin為底物發生乙酰化的預測

P值越小，其位點發生乙酰化的幾率越大

2.4 免疫熒光檢測食管癌組織中Survivin和KAT2A蛋白表達免疫熒光結果顯示：Survivin和KAT2A蛋白在食管癌組織中同時呈高表達，兩者主要表達于細胞質中，部分表達于細胞核中(圖4)。

2.5 食管癌組織中Survivin乙酰化和KAT2A的相關性相關性分析顯示：食管癌組織中Survivin乙酰化和KAT2A表達呈正相關性(r=0.326，P=0.025，表2)。

表2 食管癌組織中Survivin乙酰化與KAT2A的相關性

2.6 食管癌EC109和正常食管黏膜上皮HEEC細胞中KAT2A和Survivin乙酰化蛋白表達KAT2A在EC109細胞中陽性率為(87.36±4.24)%，高于HEEC細胞中的(17.45±2.78)%。EC109細胞內Survivin蛋白乙酰化水平為(87.79±4.12)%，高于HEEC細胞的(21.28±3.78)%(圖5)。

圖4 免疫熒光檢測Survivin和KAT2A在食管癌組織中表達：Survivin綠色熒光，KAT2A紅色熒光，DAPI細胞核染色，MERGE為三圖融合圖像

圖5 人食管癌EC109和正常食管黏膜上皮HEEC細胞系中KAT2A表達和Survivin乙酰化水平：A.Western blot和免疫共沉淀法測定KAT2A表達和Survivin乙酰化；B.定量檢測KAT2A蛋白表達；C.定量檢測Survivin乙酰化蛋白表達；**P<0.01

2.7 下調KAT2A對Survivin mRNA和蛋白表達及Survivin蛋白乙酰化水平的影響合成的KAT2A-siRNA含有cy3紅色熒光標簽，轉染EC109細胞成功后可見細胞內有紅色熒光表達(圖6)。qRT-PCR檢測三組細胞內KAT2A mRNA和蛋白表達量結果顯示：si-K組mRNA和蛋白表達量明顯低于si-N組及NC組(P<0.05，圖7)，說明設計合成下調KAT2A的RNA干擾序列有效。si-K組Survivin mRNA和蛋白表達量與si-N和NC組相比差異無統計學意義(P>0.05，圖8)，說明RNA干擾下調KAT2A后對Survivin mRNA和蛋白表達無影響。RNA干擾下調KAT2A后，si-K組Survivin蛋白乙酰化水平顯著下降，而si-N組和NC組Survivin蛋白乙酰化水平變化差異無統計學意義(P>0.05，圖9)。

明視野熒光視野疊加圖

圖7 RNA干擾KAT2A后KAT2A mRNA和蛋白表達量變化：A. KAT2A蛋白表達量；B.KAT2A mRNA相對表達量；與si-K相比，*P<0.05

2.8 下調KAT2A對wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達的影響Western blot結果顯示：與si-N組和NC組相比，si-K組中wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達量顯著下降(P<0.05)。si-N組和NC組相比，wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達無變化(圖10)。

圖8 RNA干擾KAT2A對Survivin mRNA和蛋白表達量的影響：A. Survivin蛋白表達量；B. Survivin mRNA相對表達量

圖9 RNA干擾下調KAT2A對Survivin蛋白乙酰化水平的影響

圖10 下調KAT2A對wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達水平的影響

2.9 下調KAT2A對EC109細胞存活、遷移和侵襲能力的影響MTT實驗結果顯示：與si-N組和NC組相比，si-K組中EC109細胞的吸光度值顯著降低，細胞存活能力下降(圖11)。劃痕愈合實驗結果顯示：si-K組中EC109細胞劃痕愈合緩慢，遷移能力下降(圖12)。Transwell小室侵襲實驗結果顯示：si-K組中EC109細胞穿膜數量顯著減少，侵襲能力下降(圖13)。

圖11 下調KAT2A對食管癌EC109細胞存活能力的影響：與si-K相比，*P<0.05

圖12 下調KAT2A對食管癌EC109細胞遷移能力的影響

si-Ksi-NNC

3 討論

食管癌的發病較隱匿，部分患者發現時已發生遠處轉移，總體預后不佳[7]。隨著現代醫學對基因的深入研究，靶向治療為食管癌患者提供了更好的選擇。因此，篩查食管癌發病相關因子為臨床提供診療靶點成為目前醫學領域研究的新熱點。蛋白乙酰化修飾參與多種生命活動，在調控腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲機制過程中具有十分重要的作用[8]。近年研究發現非組蛋白也可以發生乙酰化，且與腫瘤的發生發展密切相關[9]。Survivin蛋白是一種凋亡抑制基因產物，在多種腫瘤中呈高表達，并與細胞的增殖和凋亡密切相關[10-11]。本課題組前期研究表明，Survivin蛋白與食管癌TNM分期、組織分化和淋巴結轉移密切相關[12]。本實驗證實，Survivin蛋白在食管癌組織中呈高表達并發生乙酰化，且癌組織中乙酰化率顯著高于正常組織。進一步通過免疫共沉淀證實：在食管癌組織和EC109細胞中Survivin蛋白作為一種非組蛋白發生乙酰化，其結果與課題組在食管癌組織中的研究結果一致。然而，Survivin蛋白乙酰化參與食管癌發生、發展的深入機制仍不明確。

KAT2A屬于組蛋白乙酰轉移酶GNAT超家族的成員之一，可以催化多種蛋白底物發生乙酰化，并參與多種癌癥的發生和發展[13-14]。本實驗結果證實KAT2A在癌組織中表達升高，但在食管癌中KAT2A作為乙酰基轉移酶能否催化Survivin的乙酰化修飾進而調控食管癌的發生發展尚需進一步驗證。進一步通過生物信息學預測結果顯示，乙酰基轉移酶KAT2A可以將Survivin作為底物催化其發生乙酰化，其可能發生乙酰化的賴氨酸(K)為121和349號位點。免疫熒光實驗證實，Survivin和KAT2A共同表達于食管癌細胞質，且兩者同時呈高表達狀態，且KAT2A表達與Survivin乙酰化呈正相關；提示在食管癌中KAT2A可以與Survivin相互作用，KAT2A作為乙酰基轉移酶可能參與Survivin蛋白的乙酰化修飾。

在沉默乙酰基轉移酶促進相關蛋白發生去乙酰化作用機制中，下調KAT2A有可能發揮更高的去乙酰化作用。故本實驗設計合成KAT2A的siRNA干擾序列并轉染食管癌EC109細胞，結果顯示：KAT2A基因下調后食管癌細胞內Survivin蛋白乙酰化水平降低，提示Survivin的乙酰化修飾受乙酰基轉移酶KAT2A的調控，KAT2A是Survivin蛋白發生乙酰化的上游分子。細胞功能實驗結果顯示：下調KAT2A后，EC109細胞的存活能力下降，細胞的愈合遷移距離縮短，穿過濾膜的細胞數量明顯減少，提示下調KAT2A降低Survivin乙酰化水平后，抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

上皮-間質轉變在惡性腫瘤的侵襲及轉移過程中具有重要作用[15]。腫瘤的上皮-間質轉化與Wnt/β-catenin信號通路的異常表達密切相關[16-17]。當Wnt/β-catenin信號通路異常激活時，多種因子可與β-catenin相互作用，使β-catenin由胞質轉移至核內，Wnt/β-catenin信號通路相關因子發生改變，從而誘導細胞癌變[18-19]。本組檢測Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達結果證實：下調KAT2A可降低wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達量，提示下調KAT2A降低Survivin乙酰化水平后，可阻止Wnt/β-catenin通路的信號傳導，進而影響食管癌細胞的存活、遷移及侵襲能力。

綜上，食管癌中乙酰基轉移酶KAT2A與Survivin乙酰化修飾密切相關。外源性RNA干擾下調KAT2A表達能夠降低Survivin乙酰化水平，并抑制Wnt/β-catenin信號傳導通路，進而抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。KAT2A作為乙酰基轉移酶可能是調控Survivin發生乙酰化的重要上游分子學事件，為食管癌的臨床治療提供新的分子靶點。