EGFR突變和CIP2A表達與肺腺癌臨床特征的關系及相關性

孫曉靜，陳 穎，阮 婷，呂彥天

目前肺癌的靶向治療，尤其是EGFR-TKI治療，可以顯著提高EGFR突變患者的生存，但患者的5年生存率仍較低(10%～20%)[1]，治療中多發生耐藥[2-4]。尋找肺癌耐藥的相關機制，是臨床面臨的迫切任務。2007年研究表明，CIP2A是一種與PP2A相互作用的內源性抑制因子，CIP2A在肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且CIP2A高表達與肺癌預后不良相關，CIP2A缺失可顯著抑制癌細胞的增殖和凋亡[5-7]。激活EGFR信號可通過MEK-MAPK途徑上調CIP2A表達，而CIP2A可通過PI3K-AKT途徑介導厄洛替尼誘導EGFR野生型非小細胞肺癌細胞凋亡和肺癌的增殖[8-9]。本文旨在探討肺腺癌中EGFR突變和CIP2A表達與臨床病理特征的關系，為臨床與病理醫師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年3月～2016年1月南京醫科大學附屬蘇州醫院經手術切除、氣管鏡活檢及肺穿刺活檢的105例肺腺癌組織。另收集78例距離癌組織邊緣5 cm以上相應癌旁組織，且病理證實為正常肺組織。105例患者中，男性48例，女性57例，中位年齡57歲；吸煙者46例，非吸煙者59例；肺癌分期依據第八版UICC/AJCC分期標準：0/Ⅰ期49例，Ⅱ期24例，Ⅲ期18例，Ⅳ期14例。根據2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌分類：原位腺癌(adenocarcinoma in situ, AIS)13例，微浸潤腺癌(microinvasive adenocarcinoma, MIA)29例，浸潤腺癌(invasive adenocarcinoma, IA)63例。本實驗經南京醫科大學附屬蘇州醫院醫學研究倫理委員會批準，患者均知情同意。

患者術后隨訪包括臨床癥狀、腫瘤標志物、影像檢查等。隨訪截至2021年2月，52例患者接受了輔助治療(化療或EGFR-TKI治療)。其中42例患者復發，27例死亡。總生存期為確診至患者死亡或隨訪結束時間，其中死亡病例通過電話隨訪、住院記錄或入戶調查確定。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 免疫組化染色采用SP法，嚴格按試劑盒說明進行操作，一抗CIP2A(ab84547)稀釋濃度為1 ∶100。每張切片隨機計數5個視野，每個視野計數200個腫瘤細胞。PBS代替一抗作為陰性對照。根據染色陽性細胞占整個癌區或良性組織的百分比評估表達分級：陰性(0～5%)、弱陽性(5%～25%)、中等陽性(26%～50%)和強陽性(51%～100%)，切片均經兩名經驗豐富的病理醫師采用雙盲法判讀。

1.2.2EGFR突變檢測 石蠟包埋肺癌組織以10 μm厚切片，送至病理實驗室或基因公司提取DNA，并通過探針擴增阻滯突變系統(amplification refractory mutation system, ARMS)法檢測EGFR突變狀態[10]。

1.2.3Western blot檢測 不同肺癌細胞株A549、H1975、H460、PC-9、H520、H1975、H226、SKMES、HCC827、HCC827-GR(由蘇州大學呼吸研究所惠贈)及人正常肺上皮細胞BEAS-2B培養于6孔板中，棄去培養上清，PBS清洗2次，每孔加入200 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天公司)，輕輕搖晃1～2 min后，收集裂解液至EP管，放入100 ℃水浴中變性7 min，-20 ℃冷卻備用。以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，140 mA、90 min，冰浴條件下用NC膜轉膜，200 mV、120 min，快速封閉液(碧云天公司)封閉NC膜15 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌4次后，加入二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2～3 h，ECL發光液化學發光，放入Biorad凝膠成像儀曝光。

1.2.4CIP2A干擾細胞株的構建 靶向作用于CIP2A的siRNA慢病毒序列由上海吉滿公司合成，干擾序列1：5′-AAACTTCTCTCAACATACTAGC-3′，干擾序列2：5′-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3′，對照序列：5′-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3′，將肺癌H1975細胞株鋪在6孔板中培養，待細胞長至板底的60%，PBS洗2次去除死細胞和代謝物，更換為2 mL含1%FBS的RPMI-1640培養基，每孔加入5 μL siRNA(空白對照及干擾序列，病毒滴度1×108TU/mL)，培養24 h后PBS洗2次，重新更換2 mL完全培養基培養，轉染48～72 h后收集細胞蛋白，Western blot檢測干擾效果。

1.2.5CCK-8細胞增殖實驗 將構建的干擾CIP2A的肺癌細胞株H1975消化后用含10%FBS的RPMI-1640培養基重懸細胞，調整細胞密度為每毫升3×104個，取96孔板，根據實驗不同分組，每組設4個復孔，以24、48、72及96 h為時間點。在不同時間點向待測孔中緩慢加入CCK-8試劑10 μL，繼續培養2 h，酶標儀檢測相應孔的OD值，并繪制增殖曲線。

1.2.6細胞周期檢測 取對數生長期的干擾CIP2A的H1975肺癌細胞株，消化離心后加入1 mL冰浴預冷的PBS重懸后離心，后再加入1 mL冰浴預冷的70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4 ℃固定24 h，1 000g離心5 min，沉淀細胞。每個樣品加入0.5 mL染色緩沖液，碘化丙啶染色液(1 ∶20)25 μL，RNase A(1 ∶50)10 μL。分成H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三組細胞，每組3個復孔，BD流式細胞儀根據程序設定測定各樣品周期。

1.2.7細胞遷移、侵襲實驗 取對數生長期的干擾CIP2A的肺癌細胞株H1975，消化離心，以無血清的RPMI-1640培養基重懸計數，每毫升1.5×105個H1975細胞接種到Tranwell上室中[侵襲實驗時Transwell上室預鋪50 μL Matrigel膠(1 ∶7)凝固后，每毫升加2.5×105個H1975細胞接種到Tranwell上室中]，下室加入10%FBS RPMI-1640培養基。分H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三組，每組設3個復孔，培養箱中孵育24 h，用棉簽輕輕拭去上室肺癌細胞，甲醇固定30 min后，用0.1%結晶紫染色0.5 h后風干，顯微鏡下拍照。

1.3 統計學分析所有數據采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。χ2檢驗比較CIP2A蛋白和EGFR突變在肺腺癌和正常肺組織中的表達及與臨床病理特征關系，Spearson法分析CIP2A蛋白表達與EGFR突變狀態的相關性，Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，ImageJ 7.1軟件測定Western blot蛋白表達的相對灰度值。肺癌細胞株組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌中CIP2A的表達CIP2A蛋白表達主要定位于肺腺癌細胞胞質中。105例肺腺癌組織中CIP2A的陽性率為64.76%(68/105)，78例癌旁組織中CIP2A的陽性率為8.97%(7/78)(圖1，表1)。CIP2A在肺腺癌組織中強陽性28例，中等陽性26例，弱陽性14例，而癌旁組織中CIP2A均為弱陽性。EGFR突變型肺癌中CIP2A的表達較EGFR野生型高(圖1)。χ2檢驗發現，CIP2A在肺腺癌組織中的陽性率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.001)。

ABCDEF

表1 肺腺癌及癌旁肺組織中CIP2A的表達

2.2 肺腺癌中EGFR突變情況ARMS法檢測發現，105例肺腺癌組織中45例為EGFR野生型，60例存在EGFR突變，其中18外顯子突變(G719X)2例，18和19外顯子共同突變1例，20外顯子突變3例，19外顯子缺失(19del)33例，21外顯子突變(L858R)21例。

2.3 肺腺癌中CIP2A表達與EGFR突變的相關性60例EGFR突變型肺腺癌中55例CIP2A蛋白陽性，45例EGFR野生型肺腺癌中13例CIP2A蛋白陽性。Spearson相關分析顯示：肺腺癌組織中EGFR突變與CIP2A蛋白表達呈正相關(r=0.650，P<0.001，表2)。

表2 肺腺癌EGFR突變與CIP2A表達的相關性

2.4 肺腺癌患者無進展生存相關的預后因素進一步將患者年齡、性別、吸煙情況、病理分期、EGFR突變狀態及CIP2A表達進行Kaplan-Meier生存分析發現，患者年齡(P=0.195)、性別(P=0.918)、吸煙狀態(P=0.203)與預后無明顯相關性，而病理分期(HR=5.715，95%CI=1.612～20.260，P=0.002)、CIP2A表達(HR=1.946，95%CI=0.662～5.716，P=0.015)、EGFR突變狀態(HR=2.870，95%CI=1.105～7.445，P=0.037)與預后具有相關性(表3)。

表3 肺腺癌患者預后單因素分析

2.5 肺癌細胞株中CIP2A的表達本實驗進一步分析CIP2A在不同肺癌細胞株和正常肺上皮細胞中的表達，發現CIP2A在肺癌細胞株中具有不同水平的表達，而正常肺上皮細胞無明顯表達。ImageJ軟件進一步測量CIP2A蛋白的相對表達量，在EGFR敏感突變株HCC827(19del)和PC-9(19del)中CIP2A的相對表達量分別為0.41和0.55，而在EGFR耐藥突變株中H1975(T790M)中表達更高，相對表達量為0.89(圖2A)。同時選取HCC827和吉非替尼誘導后耐藥的HCC827-GR檢測CIP2A的表達，發現吉非替尼誘導耐藥后CIP2A的表達明顯升高(0.56vs0.92)(圖2B)。

圖2 Western blot法檢測肺癌細胞株中相關蛋白的表達：A. CIP2A在不同肺癌細胞株中的表達；B. HCC827及吉非替尼耐藥細胞株HCC827-GR中CIP2A的表達

2.6 CIP2A干擾肺癌細胞株的構建以EGFR耐藥突變株H1975為細胞系，建立干擾CIP2A的細胞株，干擾CIP2A表達后，CIP2A蛋白表達水平明顯降低(相對蛋白表達量由0.81降至為0.15、0.12)，表明細胞株構建成功(3A)。應用Western blot法檢測干擾CIP2A后肺腺癌常見信號通路EGFR相關信號通路PI3K及MAPK通路相關蛋白表達結果顯示：干擾CIP2A后，H1975的P-AKT蛋白明顯抑制(相對蛋白表達量由0.95降至0.51、0.44，而P-ERK蛋白無明顯變化(蛋白表達量分別為0.81、0.79、0.83)(圖3B)，表明PI3K-AKT通路可能參與肺腺癌中CI2PA介導EGFR-TKI耐藥的通路。

2.7 干擾CIP2A后肺癌細胞功能實驗細胞增殖：干擾CIP2A后，48 h開始H1975-Sh-1和H1975-Sh-2組細胞較H1975-Sh-NC組細胞增殖速度減慢，72 h后更為顯著(H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2組的OD值分別為2.12±0.34、1.51±0.23、1.60±0.21，P<0.01)，表明干擾CIP2A可抑制肺癌細胞的增殖(圖4)。

圖3 A.驗證干擾CIP2A肺癌細胞株構建；B.干擾CIP2A后肺癌細胞株中相關信號通路的變化

圖4 干擾CIP2A對肺癌細胞增殖的影響

細胞周期：干擾CIP2A后，H1975-Sh-1、H1975-Sh-2組細胞周期G1期占(68.93±3.56)%，G2期占(3.14±0.21)%，S期占(27.11±1.53)%，H1975-Sh-NC組G1期占(57.50±2.06)%，G2期占(6.34±0.83)%，S期占(36.08±2.09)%，差異具有統計學意義(P<0.01，圖5)，表明干擾CIP2A后，肺癌細胞G1期增加，S期及G2期減少，增殖受抑制。

圖5 干擾CIP2A后肺癌細胞周期的變化

細胞遷移和侵襲：遷移實驗顯示，H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三組透過Transwell下室的平均每視野細胞數分別為387±46、125±29、98±17(P<0.01)；侵襲實驗顯示，H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三組透過Transwell下室的平均每視野細胞數分別為279±35、95±28、67±12(P<0.01)，提示干擾CIP2A可抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力(圖6)。

圖6 干擾CIP2A對肺癌細胞遷移和侵襲的影響

本實驗進一步用H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1組細胞加入吉非替尼后研究干擾CIP2A后細胞增殖變化。從第3天開始H1975-Sh-1組較H1975-Sh-NC組細胞增殖速度減慢，在第4天更為明顯(2.84±0.25vs1.72±0.18，P<0.01)，提示干擾CIP2A可部分恢復肺癌細胞對EGFR-TKI的敏感性(圖7)。

圖7 加入吉非替尼對干擾CIP2A肺腺癌細胞增殖的影響

3 討論

目前證實CIP2A在許多實體和血液腫瘤中過表達，CIP2A過表達是胃癌、卵巢癌和舌癌等許多癌癥的不良預后因素[11-12]，這可能與CIP2A和c-Myc形成的正反饋有關。目前，CIP2A在肺癌中的研究數據有限，結果也不完全一致。多數報道證實CIP2A在肺癌組織中過表達，但其與臨床病理特征的關系尚不清楚。Xu等[6]研究顯示，CIP2A表達與患者性別、年齡、吸煙、TNM分期、病理類型和組織學分化無關。Cha等[7]研究表明，CIP2A過表達與淋巴結轉移和病理分期相關。在預后方面，多數研究顯示CIP2A表達與患者預后不良相關[5-7,12]；本實驗發現CIP2A在肺腺癌組織中高表達，并與患者預后相關。各研究結論不盡相同的原因可能與入組樣本量、鑒定CIP2A表達的參考水平不一致以及各分期患者數量不同相關。

CIP2A具有促進肺癌增殖的作用，抑制CIP2A表達，肺癌細胞增殖受到抑制并促進凋亡的形成[8]。本實驗首先通過免疫組化檢測肺癌組織，發現CIP2A與EGFR突變之間具有相關性，并且CIP2A在EGFR突變型肺腺癌中的表達量相對更高，兩者可能在肺癌的治療中具有協同作用。EGFR信號通路通常由MEK-MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT信號通路介導，可促進細胞增殖、血管生成、遷移、黏附和存活[13]。研究表明[14]，CIP2A表達受EGFR-MEK-ETS1通路、p53失活、E2F1和ATF-2(激活轉錄因子2)調控，因此，推測EGFR可以通過MEK-MAPK途徑促進CIP2A在腫瘤中的表達，而EGFR突變型比EGFR野生型更有能力激活下游信號通路。在EGFR野生型患者中，厄洛替尼與多西他賽或培美曲塞的療效差異無統計學意義(P=0.37)，表明EGFR-TKI在肺癌治療中的作用不一定完全依賴EGFR突變，而這種抗腫瘤作用可能與抑制CIP2A蛋白有關[8]。因此，有必要從分子水平進一步研究EGFR突變(包括耐藥突變)和CIP2A在肺癌細胞增殖和侵襲中的作用。

EGFR是近年來在治療晚期肺癌中發現的最具治療性的分子標志物。EGFR-TKI已成為EGFR突變晚期肺癌患者一線治療的首選。然而，絕大多數患者在獲得9.2～19.3個月的無進展生存期后，不可避免地因后續繼發耐藥而導致疾病進展[2-3]。目前關于EGFR-TKI繼發耐藥的機制已有大量研究報道[15-16]，主要分為EGFR依賴型和EGFR非依賴型。EGFR-T790M突變是第一、二代EGFR-TKIs EGFR依賴性獲得性耐藥最主要的原因，占50%～60%[17-18]。其耐藥機制為當EGFR-T790M突變時，EGFR蛋白ATP結合囊中的T790M殘基可增強其與ATP的親和力，從而介導EGFR-TKI的抗性并降低其療效[19]。H1975細胞株是具有T790M突變的肺腺癌細胞株，故選用H1975細胞株作為本實驗后續的CIP2A干擾細胞株。本實驗發現，干擾CIP2A后肺癌細胞株表現為抑制腫瘤增殖、遷移及侵襲的表型變化。為進一步研究哪些信號通路參與此種改變，本實驗應用Western blot法檢測常見的EGFR相關信號通路PI3K及MAPK通路相關蛋白表達，結果顯示：干擾CIP2A后，肺癌細胞中P-AKT蛋白明顯抑制，而P-ERK蛋白無明顯變化，表明PI3K-AKT通路可能參與了CI2PA介導EGFR-TKI耐藥的通路。PI3K是細胞內脂質激酶家族的成員，其中PIK3α可以PIP2磷酸化為PIP3，后者能夠激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，進而調節腫瘤細胞增殖能力。有研究顯示PI3K-AKT/mTOR通路激活可能與EGFR耐藥相關，發生率為4%～11%，其中包括E545K、E542K、R88Q、N345K和E418K突變[20]。

另外，Saafan等[21]在適應厄洛替尼的非小細胞肺癌細胞系HCC4006rErlo0.5中發現，構成細胞增殖調節CIP2A的基因表達明顯升高，可作為獲得性耐藥的模型，并且CIP2A可導致AKT信號的結構性激活，本實驗結論與之一致。除了肺癌，在乳腺癌研究中[22]，CIP2A過表達使乳腺癌細胞株SKBR3和78617對拉帕替尼(ErbB2/EGFR抑制劑)誘導的細胞凋亡和生長抑制具有抗性；相反，通過慢病毒shRNA干擾CIP2A可增強細胞對拉帕替尼誘導的生長抑制和細胞凋亡的敏感性。這些研究表明，CIP2A在EGFR-TKI繼發的耐藥研究中具有更進一步深入研究的價值。

綜上，肺腺癌中CIP2A表達明顯增加，并與EGFR突變呈正相關。EGFR-TKI耐藥可能與CIP2A高表達有關，干擾CIP2A可能成為肺癌靶向治療的新思路，未來仍需要進一步探討CIP2A在肺癌EGFR突變耐藥方面的機制。