原發性肺淋巴上皮癌41例臨床病理及分子遺傳學分析

馬善寶，鄭巧靈，延永琴，齊興峰，劉慶宏，曲利娟

肺淋巴上皮癌(lymphoepithelioma carcinoma, LEC)是一種具有大量淋巴間質、分化差的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，為臨床少見的、與EBV感染密切相關的惡性上皮性腫瘤，可發生于全身任何器官，僅占所有肺癌的0.92%。由于肺LEC的低發病率、發病機制及驅動基因突變不明確，目前臨床治療經驗有限。隨著免疫療法的興起，程序性細胞死亡1(programmed death-1, PD-1)/程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)抑制劑已成為NSCLC的重要治療方法[1]，但PD-1/PD-L1在肺LEC中的表達及相關治療療效數據有限，仍有待進一步探究。本文回顧性分析41肺LEC臨床病理特征及PD-1/PD-L1在肺LEC中的表達情況，為臨床開展新的免疫治療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年1月～2021年12月解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院病理科存檔的肺LEC手術切除標本41例，所有患者均接受鼻咽內鏡檢查以排除鼻咽部轉移性LEC，臨床病理資料完整。其中發病年齡27～77歲，中位年齡54歲，男女比為1.2 ∶1，其中吸煙者4例。按照第8版肺癌腫瘤TNM分期系統進行分期。隨訪資料通過電話形式獲取信息，隨訪時間6～54個月，其中3例出現胸腔、肝和骨等部位遠處轉移。

1.2 方法標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，行HE及免疫組化染色，鏡下觀察。PD-1抗體(稀釋比1 ∶50)購自SIGMA公司，PD-L1(克隆號SP263)檢測采用羅氏OptiView法，每次實驗均設置陽性和陰性對照，其余免疫組化檢測試劑盒購于福州邁新公司，免疫組化染色采用EnVision兩步法，所用抗體包括CK5/6、p40、p63、CK7、TTF-1、Napsin A、Syn、CgA、CD56。EBER原位雜交染色試劑盒購自北京中杉金橋公司，采用辣根過氧化物酶系統，DAB顯色。另切取相應石蠟包埋組織4 μm厚切片5～10張，利用石蠟組織DNA/RNA共提取試劑盒提取DNA及RNA，采用擴增阻滯突變系統(ARMS)PCR檢測RET、ROS1、EGFR、HER-2、PIK3CA、BRAF、KRAS和ALK基因突變情況，PCR具體操作及結果判讀均按試劑盒說明書進行，試劑盒購自廈門艾德生物醫藥公司。

1.3 結果判斷CK5/6、CK7、Napsin A、Syn、CgA表達定位于細胞質，CD56表達定位于細胞膜，p40、p63、TTF-1表達定位于細胞核。PD-L1陽性判斷[2-3]：以任何強度的細胞質或細胞膜染色腫瘤細胞占所有腫瘤細胞的百分比計算：0～1%為陰性，≥1%為陽性，其中1%～49%為低表達，≥50%為高表達。PD-1陽性判斷[4-5]：以細胞計數法評估：低倍鏡下觀察整張切片，尋找淋巴細胞密度較高處，隨機選擇5個高倍視野(400×)，每個視野計數100個細胞中PD-1陽性細胞數，求其平均值作為PD-1陽性細胞數。以所有病例PD-1陽性細胞數均數為閾值，>該閾值即為PD-1陽性，<該閾值即為PD-1陰性。

1.4 統計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，當樣本量<5時進行Fisher確切檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征本組41例LEC中有34例(34/41，82.93%)無癥狀患者為體檢偶然發現，僅7例(7/41，17.07%)患者出現臨床癥狀，主要表現為咳嗽、咳痰、咯血或胸悶。腫瘤部位：中央型11例、周圍型30例，具體分別為左肺上葉2例(5%)、左肺下葉11例(27%)、左下肺門2例(5%)、右肺上葉6例(14%)、右肺下葉13例(32%)、右肺中葉7例(17%)。臨床分期：Ⅰ期21例(51%)，Ⅱ期4例(10%)，Ⅲ期13例(32%)，Ⅳ期3例(7%)。所有患者均在首診時進行了血清腫瘤標志物檢測：CA199升高1例，CA125和CEA升高各2例，NSE升高4例，細胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)升高11例，其他血清腫瘤標志物均陰性。所有患者均經手術切除病灶，接受新輔助治療者3例，接受輔助治療者19例，化療周期>4個療程者7例。隨訪截至2021年12月31日，隨訪時間6～54個月，患者均存活，其中3例分別出現胸腔、肝和骨轉移。

2.2 病理檢查眼觀：41例手術根治標本，腫瘤呈結節狀，大小不等，腫瘤最大徑0.5～9.8 cm(中位最大徑3.2 cm)，均無明顯包膜，境界欠清，切面灰白色，質中，部分伴壞死。鏡檢：41例腫瘤組織學特點相似，低倍鏡下腫瘤細胞呈彌漫片狀浸潤性生長，具有明顯的推進性邊界；腫瘤細胞界限不清，呈合體細胞樣生長，細胞核大、空泡狀，具有明顯的嗜酸性核仁；間質有明顯的淋巴上皮病變及炎性反應，浸潤細胞以成熟的淋巴細胞為主，常伴有漿細胞和組織細胞(圖1)，個別病例伴嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞；部分病例可見肉芽腫性炎(8例)(圖2)、局灶角化(4例)(圖3)、肺泡腔播散(3例)。

2.3 免疫表型及原位雜交腫瘤細胞CK5/6(41/41)(圖4)、p40(41/41)(圖5)、p63(41/41)、PD-L1(37/41)陽性，其中16例(16/41)腫瘤細胞PD-L1呈高表達(圖6)；17例(17/41)腫瘤間質淋巴細胞PD-1陽性(圖7)，CK7、TTF-1、Napsin A、Syn、CgA、CD56陰性。PD-L1和PD-1表達與LEC患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分期等均無相關性(P>0.05，表1)。EBER原位雜交檢測結果均呈陽性(圖8)。

2.4 基因檢測本組11例行基因突變檢測，包括RET基因融合、ROS1基因融合、EGFR基因突變、HER-2基因突變、PIK3CA基因突變、BRAF基因突變、KRAS基因突變、ALK基因重排，結果均呈陰性。

3 討論

LEC是一種罕見且獨特的肺癌亞型，好發于較為年輕且非吸煙的東南亞地區和中國的患者，無明顯性別差異[6]。WHO(2021)肺腫瘤分型系統將淋巴上皮瘤樣癌的名稱更改為淋巴上皮癌，并歸類于鱗狀細胞癌分類目錄下[7]，其組織學上與鼻咽癌非常類似，腫瘤免疫微環境中存在大量浸潤淋巴細胞。大多數肺LEC患者無明顯臨床表現，少數患者伴發熱、咯血、咳嗽、咳痰及胸悶等癥狀。肺LEC好發于左下肺葉和右中肺，但很少發生于右上肺[8]。本組41例患者多是通過體檢偶然發現肺部結節，僅4例有吸煙史，男女比為1.2 ∶1，發病年齡27～77歲，中位年齡54歲，腫瘤的發生部位多見于右肺下葉(32%)和左肺下葉(27%)，少見于左肺上葉(5%)和左下肺門(5%)。除外腫瘤發生部位，其余臨床癥狀與既往報道相似。

血清腫瘤相關標志物對惡性腫瘤的輔助診斷、治療和疾病監測具有重要作用。然而，肺LEC中血清腫瘤標志物的特征尚不清楚。肺LEC患者血漿中的循環EBV-DNA含量可預測疾病進展和治療反應情況，較高的EBV濃度可能與腫瘤進展和癌癥分期相關[9]。有學者報道血清NSE和Cyfra21-1水平可能與疾病的活動性相關，可用于監測早期腫瘤復發，因此建議在肺LEC治療期間進行定期隨訪[10]。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表1 41例原發性肺淋巴上皮癌患者PD-L1和PD-1表達與臨床病理特征的關系

Qin等[11]發現肺LEC患者的CA125升高率達25.3%(20/79)，這提示CA125升高可能是預測肺LEC的標志物之一。本組病例均在首診時進行了血清腫瘤標志物檢測，1例患者CA199升高，各有2例患者CA125和CEA升高，4例患者NSE升高，11例患者Cyfra21-1升高，其他腫瘤標志物均陰性。

肺LEC的組織病理特征與未分化的鼻咽癌類似，是一種分化差并混有明顯淋巴細胞浸潤及癌細胞核內存在EBV的獨特類型的腫瘤，需與轉移性鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤進行區分。有研究發現肺LEC的一些明顯的病理形態學特征，包括小灶角化、肉芽腫性炎以及肺泡腔擴散和鱗狀擴散模式[12]。本組患者通過鼻咽內鏡檢查排除了鼻咽部轉移性LEC，其中有8例出現肉芽腫性炎、4例出現局灶角化和3例出現肺泡腔播散。免疫組化可為了解不同腫瘤的分化來源等生物學特征提供線索，本組病例表達CK5/6、p40、p63、PD-L1，不表達神經內分泌標志物(Syn、CgA、CD56)和腺上皮標志物(CK7、TTF-1、Napsin A)，所有病例EBER原位雜交均呈陽性，提示肺LEC起源于上皮組織，本質上屬于鱗狀細胞癌的一種亞型。此外，腫瘤間質淋巴細胞PD-1陽性率達41.46%(17/41)，這提示腫瘤相關微環境中存在著大量的免疫效應細胞。

目前，肺LEC的分子機制和發病機制尚未明確。在整合基因組和轉錄組分析中發現[13]，肺LEC中腫瘤相關基因鋅指和BTB結構域16(zinc finger and BTB domain containing 16, ZBTB16)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activated receptors γ, PPARγ)和重組人轉化生長因子β受體2(recombinant human transforming growth factor beta receptor 2, TGFBR2)顯著下調，同時存在拷貝數變異(copy number variations, CNVs)的丟失，但缺乏NSCLC中常見的驅動基因突變(如EGFR、KRAS和BRAF等)。因此，肺LEC缺乏驅動突變因子可能會使腫瘤細胞的侵襲性降低，并可能導致肺LEC患者的生存率增加。此外，EBV可以促進BART5-3P的表達，TP53突變和PD-L1表達與無瘤生存期(disease-free survival, DFS)相關，這些發現為肺LEC的分子機制研究提供了新見解。本組病例未檢測到PIK3CA、RET、ALK、ROS1、EGFR、BRAF、KRAS和HER-2基因突變。與低基因突變率不同，PD-L1在肺LEC中的陽性率達90%以上(37/41)，其中16例呈高表達(16/41, 34.15%)，但PD-L1表達與LEC患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分期等均無相關性(P>0.05)。本組PD-L1的表達水平高于既往文獻報道的數據，但PD-L1表達對肺LEC患者的預后意義存在爭議。有研究證實[14]，肺LEC中PD-L1陽性率為75%，并且PD-L1陽性患者有更長的DFS和總生存期(overall survival, OS)。另有研究表明[15]，PD-L1表達與LEC患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分期、淋巴結轉移和OS均無相關性(P>0.05)。

早期肺LEC主要通過手術治療，晚期常以放療聯合化療進行綜合治療。雖然肺LEC患者的預后優于其他亞型的NSCLC患者，但仍有部分患者出現治療耐藥性，從而出現局部腫瘤復發和(或)遠處轉移[16]。對于綜合治療失敗的肺LEC晚期患者，目前暫無統一和標準的治療措施。此外，肺LEC基因突變罕見可能提示靶向治療的低敏感性，而PD-L1在肺LEC中高表達揭示了在這一亞型肺癌中使用免疫治療的可能性[17]。并且免疫治療的有效性可能不僅取決于腫瘤組織中PD-L1表達情況，還取決于腫瘤微環境中是否有足夠的免疫效應細胞；肺LEC腫瘤周圍間質有豐富的淋巴細胞和漿細胞浸潤，這可能是肺LEC患者盡管PD-L1低表達但仍受益于免疫治療的原因之一[11]。因此，PD-1/PD-L1抑制劑可能是晚期肺LEC患者的有效治療方式之一，或許將改變晚期肺LEC患者的治療模式。本組病例均經手術切除病灶，接受新輔助治療者3例，接受輔助治療者19例，化療周期>4程者7例。腫瘤細胞和間質淋巴細胞的PD-1及PD-L1陽性率較高，分別為90.24%、41.46%，這為腫瘤的免疫治療提供了依據。目前患者均存活且狀態良好，其中3例分別出現胸腔、肝和骨轉移，并且將繼續接受輔助治療。

綜上，肺LEC是一種少見且獨特亞型的肺惡性腫瘤，好發于非吸煙的年輕患者，組織學特征與鼻咽癌相似，且與EBV密切相關。因此，診斷肺LEC首先要排除鼻咽等部位的腫瘤轉移。由于發病率低和病例信息有限，缺乏標準的治療模式，肺LEC治療方式主要通過手術、放療和化療。由于腫瘤相關基因突變率低，晚期肺LEC患者不太可能從靶向治療中獲益。PD-1及PD-L1在肺LEC中高表達使得免疫治療成為肺LEC治療熱點，但仍需進一步的臨床研究驗證。由于樣本量及隨訪時間有限，未來將開展具有足夠長隨訪時間的多中心研究，以提供更多的證據來確定肺LEC的最佳治療策略。