BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌303例臨床病理學特征

李 棟，劉藝璇，李雪晴，王麗麗，林東亮，谷海燕，王婧楠，王繼綱

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，我國甲狀腺癌的發病率在過去幾十年內始終處于上升趨勢。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer, PTC)是甲狀腺癌中最常見的類型，占85%～90%[1]，文獻報道東亞人群中BRAF V600E基因突變率遠高于西方國家，在日本PTC人群中BRAF V600E基因突變率約為85%[2]，在美國PTC人群中BRAF V600E基因突變率約40%[3]。一般認為BRAF V600E突變型PTC需要更加積極的治療策略，而在臨床實踐中發現部分BRAF V600E野生型PTC也具有高侵襲性的生物學行為。目前，國內尚無BRAF V600E野生型PTC的大樣本研究報道，有關該類型的臨床病理特征以及基因學變異特點尚待進一步分析。本文收集303例BRAF V600E野生型PTC，探討其臨床病理特征、診斷、鑒別診斷，為臨床和病理醫師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年1月～2021年11月青島大學附屬醫院PTC手術標本9 729例，其中4 757例行BRAF V600E免疫組化檢測；其中陽性者4 007例(84.2%)，陰性者750例(15.8%)。甲狀腺微小PTC(最大徑<1 cm)的預后良好，本組排除微小癌病例。本組共納入1 564例PTC，其中BRAF V600E陽性者1 261例(80.6%)，BRAF V600E陰性者303例(19.4%)。收集BRAF V600E陰性病例的病理切片和臨床資料，包括患者年齡、腫瘤大小、部位、數目、被膜侵犯(被膜下生長)、區域淋巴結轉移、伴發病變等情況。隨訪時間1～4年，通過查閱本院病歷存檔系統獲取術后復查影像學結果，并通過細胞病理學或組織病理學結果判斷有無術后復發。PTC組織病理學分型標準根據WHO(2017)內分泌腫瘤：包括經典型、包裹型、濾泡型(完全為濾泡性的生長方式，乳頭不超過1%，否則視為經典型)、柱狀細胞型等多種。本實驗獲得青島大學附屬醫院倫理委員會審批通過。

1.2 BRAF V600E免疫組化染色及結果判讀免疫組化染色采用美國Ventana Medical Systems開發的VENTANA anti-BRAF V600E(克隆號VE1，針對氨基酸596-606的人工合成肽)鼠單抗，在Roche Bench mark ULTRA全自動免疫組化染色平臺上進行。染色切片采用10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的組織，脫蠟后，抗原修復(細胞調理液1)100 ℃ 64 min，過氧化物酶抑制劑5 min，一抗孵育36 ℃ 16 min，Opti View DAB IHC檢測試劑盒(包括HQ Linker和HRP Multimer，Ventana Medical Systems)，用蘇木精Ⅱ和藍染試劑復染組織4 min。采用染色系統推薦的陰性試劑質控小鼠單抗代替一抗評價非特異染色，陽性對照用已知的陽性PTC切片作為質控對照。BRAF V600E(VE1)的陽性染色模式為低倍鏡下可見確切的腫瘤細胞胞質染色，結果由兩位病理醫師根據腫瘤中是否存在特異性胞質染色來評估：對腫瘤細胞內高于背景的、任何強度的明確胞質染色判定為陽性。其中，對2017年5月～2019年6月連續103例BRAF V600E陰性石蠟標本同時行ARMS-PCR檢測(ADx-ARMS BRAF基因V600E突變檢測試劑盒，廈門艾德生物公司)，檢測方法按照試劑盒說明書進行。

1.3 靶向基因二代測序采用All-in-One Cancer Panel進行測序和生物信息分析(項目編號：X101SC20051089-Z01-J001)。該方法可以檢測560個與癌癥及用藥密切相關基因以及TERT基因的啟動子突變熱點區段，有效測序深度1 000×。15例BRAF V600E野生型PTC標本(同時經免疫組化及ARMS-PCR驗證)進行測序，包括7例經典型、5例濾泡型、1例柱狀細胞型、1例嗜酸細胞型、1例實性型。測序標本采用石蠟包埋的癌和癌旁組織(11例為淋巴結，4例為癌旁正常甲狀腺組織)進行基因組DNA提取、文庫構建、庫檢及上機測序。DNA經Covaris破碎儀隨機打斷成長度為180～280 bp的片段，采用Agilent Sure Select XT Custom 試劑盒進行建庫和捕獲，末端修復和加A尾后，在片段兩端分別連接接頭進行文庫制備。帶有特異index的文庫與生物素標記的探針進行液相雜交，使用帶鏈霉素的磁珠將捕獲目標基因的目標片段，經PCR線性擴增后進行文庫質檢；根據有效濃度及數據產出需求進行Illumina Hi Seq PE150測序。測序結束獲得原始測序序列后進行基因變異信息挖掘及分析。利用Sam tools軟件檢測患者正常組織中的胚系突變，篩選可能的癌癥易感基因；將體細胞突變結果與數據庫中的已知驅動基因進行比較，篩選已知驅動基因。

1.4 統計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。采用χ2檢驗分析BRAF野生型和突變型PTC的臨床病理特征差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRAF V600E野生型PTC的臨床病理學特點303例BRAF V600E野生型PTC中，男性67例，女性236例，男女比為1 ∶3.5，年齡11～70歲，平均42歲，中位年齡43歲(圖1)；病灶最大徑1～7.5 cm，平均1.8 cm，198例有被膜侵犯(或發生于被膜下)(65.3%)，207例有區域淋巴結轉移(68.3%)，120例伴橋本甲狀腺炎(39.6%)，80例為多發病灶(26.4%)。在1 261例BRAF V600E突變型PTC中，男性298例，女性963例(男女比為1 ∶3.2)，年齡17～77歲，平均44歲(中位年齡43歲)，病灶最大徑1～8 cm，平均1.58 cm，900例有被膜侵犯或位于被膜下(71.4%)，717例有區域淋巴結轉移(56.9%)，221例伴有橋本甲狀腺炎(17.5%)，411例病灶多發(32.6%)。隨訪BRAF V600E野生型PTC患者134例，其中3例復發(出現區域淋巴結轉移，均未進行二代測序)。隨訪BRAF V600E突變型PTC患者146例，其中6例復發(出現區域淋巴結轉移)。

圖1 303例BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌的年齡及性別分布

經統計學分析顯示：與BRAF V600E突變型PTC相比，BRAF V600E野生型PTC更常伴發橋本甲狀腺炎，區域淋巴結轉移率更高，差異有統計學意義(表1)。

表1 BRAF V600E突變型與野生型甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征對比分析[n(%)]

2.2 BRAF V600E野生型PTC的病理學亞型103例BRAF V600E免疫組化陰性PTC的ARMS-PCR檢測結果均為野生型，采用免疫組化和ARMS-PCR兩種方法的檢測結果完全一致。BRAF V600E野生型PTC組織學類型：大部分為經典型(79例)，其他類型包括濾泡型21例、柱狀細胞型1例、嗜酸細胞型1例、實性型1例(圖2～6)。

2.3 BRAF V600E野生型PTC的基因變異15例BRAF V600E野生型PTC中共篩選出30個腫瘤易感基因突變(圖7)；此外，在4例樣本中檢出9個癌癥驅動基因外顯子區域的突變(表2)，其中1例濾泡型PTC出現NIN無義突變，1例經典型PTC出現CHIC2、KAT6B、AXIN1錯義突變和PHF6同義突變，1例經典型PTC出現LPHN3錯義突變和DOCK8移碼突變，1例經典型出現IKZF1和NLRP1同義突變。本組15例均未檢測到RAS基因及TERT啟動子突變。

②③④⑤⑥圖2 經典型甲狀腺乳頭狀癌:以乳頭狀結構為主,核為磨玻璃樣,常見核溝和核內假包涵體 圖3 濾泡型甲狀腺乳頭狀癌:完全或幾乎完全由濾泡構成,核磨玻璃樣,可有核溝和核內假包涵體 圖4 柱狀細胞型甲狀腺乳頭狀癌:乳頭被覆假復層柱狀上皮,缺乏典型的乳頭狀癌樣核特征 圖5 嗜酸細胞型甲狀腺乳頭狀癌:嗜酸性濾泡上皮細胞,核具有典型的乳頭狀癌樣特

表2 15例BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌標本的二代測序結果*

3 討論

BRAF V600E突變是PTC中常見的突變之一，既往研究認為BRAF V600E狀態與PTC臨床生物學行為和預后相關，BRAF V600E突變是PTC預后不良的獨立影響因素[4]。近年研究發現，BRAF V600E突變狀態與PTC患者臨床預后無相關性：BRAF V600E突變與PTC組織學亞型有關，與其他臨床病理特征未見相關性，不能作為PTC的獨立預后因子[5-6]。研究結果不同的原因可能是存在BRAF以外的其他因素，如重要的未知的驅動基因變異；其次不同人群中BRAF突變率存在顯著差異，如既往與預后相關的報道中BRAF突變率分別為48.5%、37.3%、45.7%[3-4,7]，而無預后相關的報道中BRAF突變率較高，分別為86.5%、65%、56%[5-6,8]。本組BRAF突變率為80.4%，也遠高于西方人群的報道。

圖7 15例BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌的癌癥易感基因

本組發現，相對于BRAF V600E突變型PTC，BRAF野生型PTC更常伴發橋本甲狀腺炎；在BRAF V600E突變型PTC中橋本甲狀腺炎的檢出率為17.5%，而BRAF V600E野生型PTC中的檢出率為39.6%。目前，大部分研究認為合并橋本甲狀腺炎的PTC中BRAF V600E陽性率低[9-10]，與本實驗結果基本一致。有研究表明，橋本甲狀腺炎可通過調控腫瘤特異性免疫反應來降低腫瘤的侵襲風險，抑制PTC的進展，是PTC的保護性因素[11]。然而，橋本甲狀腺炎中的濾泡上皮經常發生萎縮后不典型增生，在此基礎上可能更易發展為PTC，多為BRAF V600E野生型。

本組BRAF V600E突變型與野生型PTC的淋巴結轉移差異有顯著性，BRAF V600E突變型PTC的淋巴結轉移率是56.9%，而BRAF V600E野生型為68.3%，提示BRAF V600E野生型PTC同樣具有較強的侵襲轉移能力。既往大多數研究認為BRAF V600E突變型PTC的淋巴結轉移率更高[12]，更易發生被膜侵犯[13-14]。不同研究結果的差異可能因其他重要的驅動基因或分子生物學指標在不同人群中的分布差異，僅憑BRAF V600E指標可能難以評估真實的生物學行為。本組BRAF V600E突變型PTC被膜侵犯的比例高于野生型病例(71.4%vs65.3%)，但這并不能說明BRAF V600E是PTC發生被膜侵犯的危險因素，也不能說明BRAF V600E突變型具有較強的侵襲性，因為部分PTC好發于甲狀腺被膜下，且被膜侵犯的病理學診斷標準病理醫師的主觀性較強，作者認為以被膜外軟組織的侵犯轉移作為局部浸潤侵襲性的指標可能更具代表性。此外，Yan等[15]在研究PTC臨床病理特征時發現，BRAF V600E突變與腫瘤多灶性相關，這與本組結果一致，與BRAF V600E野生型PTC相比，BRAF V600E突變型PTC更易發生多個病灶，并且多發于雙側甲狀腺。本組中復發病例數較少(僅有9例)，且隨訪時間均未超過5年，仍不能根據區域淋巴結轉移或被膜侵犯情況來判斷預后，還需進行更長時間的隨訪來研究BRAF V600E野生型PTC的遠期結局。

文獻報道男性PTC患者的BRAF V600E基因突變率高于女性，提示男性患者預后比女性差[12]；而Basolo等[16]和本實驗結果均未顯示不同性別組中的BRAF V600E基因突變存在顯著差異，本組男性患者腫瘤BRAF V600E突變率高于女性。未來可進一步研究來驗證性別應用于PTC患者危險分層和管理時，是否應該區分BRAF V600E基因突變狀態。

本組發現BRAF V600E野生型PTC中約80%病例的組織學亞型為經典型，約20%病例為濾泡型。雖然本組并未對BRAF V600E突變型PTC的組織學亞型進行分類，但既往報道濾泡型PTC中BRAF多為野生型[17]，BRAF野生型PTC中濾泡型的比例相對較高。既往研究發現不同基因變異可能與組織學類型和生物學行為密切相關[18]：BRAF突變PTC常為經典型；RAS突變PTC多表現為濾泡型；RET/PTC1重排常發生在年輕散發的PTC患者，預后相對較好；RET/PTC3重排好發于射線暴露PTC且多為實體型；ETV6-NTRK3重排也與射線暴露相關，且具有較強的侵襲性；TERT啟動子突變好發于老年男性患者。多項大樣本的高通量測序研究均提示：BRAF和RAS突變是PTC中較為常見的基因突變，但相對于歐美國家，中國人群BRAF突變發生率高，RAS突變率低[19-20]。本組15例BRAF V600E野生型PTC中均未檢測到RAS突變，亦提示我國人群RAS突變發生率較低。進一步文獻檢索發現，本組病例檢出的9種體細胞基因突變在既往PTC測序研究中罕見報道，進一步擴大樣本量進行驗證，明確這幾種基因突變的臨床病理意義有助于對BRAF V600E野生型PTC進一步分型。

綜上，與文獻報道BRAF V600E突變可作為PTC獨立的預后危險因素不同，本組發現BRAF V600E野生型PTC更易合并橋本甲狀腺炎和淋巴結轉移，提示應對BRAF V600E野生型PTC進行進一步的危險度分層，尋找預后相關影響因素。進一步明確BRAF V600E突變對PTC的影響及其對PTC患者預后的影響，尋找其他有價值的分子生物學指標，對這類疾病的精準篩查、風險監測及個體化治療具有重要作用。