人血漿中鹽酸依匹斯汀濃度測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)、安全性研究

胡嵐嵐，張 樂(lè)，湯建林（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，重慶 400037）

依匹斯汀（epinastine，EPST）是一種具有非鎮(zhèn)靜作用的高選擇性H1受體拮抗劑。與第一代抗組胺藥物相比，鹽酸依匹斯汀難以透過(guò)血腦屏障，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用較弱[1-2]，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。臨床上多用其鹽酸鹽形式，主要用于抗過(guò)敏及哮喘的防治[3-6]。鹽酸依匹斯汀主要在肝臟內(nèi)代謝，但有報(bào)道[7]稱(chēng)其代謝程度很低，大部分進(jìn)入體內(nèi)的依匹斯汀以原型排出體外。目前國(guó)內(nèi)對(duì)鹽酸依匹斯汀的藥代動(dòng)力學(xué)（pharmacokinetics，PK）研究報(bào)道較少，測(cè)定體內(nèi)依匹斯汀血藥濃度的方法主要是高效液相色譜-紫外檢測(cè)法（high performance liquid chromatographyultraviolet，HPLC-UV）[8-12]。近期有國(guó)外研究[13-15]分別采用兩種分析方法（HPLC-UV和 UPLC-MS/MS）對(duì)依匹斯汀的人體藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，指出兩種方法均能滿足依匹斯汀的血藥濃度測(cè)定，實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)需求選擇合適的檢測(cè)方法。本文以鹽酸地芬尼多為內(nèi)標(biāo)，采用液液萃取方法處理血漿，建立了HPLCUV分析方法測(cè)定人體中鹽酸依匹斯汀的血藥濃度，以期為臨床提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters-600E型高效液相色譜系統(tǒng)及Empower色譜管理軟件（美國(guó)Waters公司）；色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司）；MC-210S型電子天平（精度0.01 mg，德國(guó)Sartorius公司）；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XH-86多用途旋渦混合器（江蘇阜寧縣羅橋校辦工廠）；Millipore超純水系統(tǒng)。

1.2 藥品與試劑

鹽酸依匹斯汀原料藥（含量99.3%，四川科瑞德制藥有限公司）；內(nèi)標(biāo)鹽酸地芬尼多對(duì)照品（含量≥99.3%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙醚（AR級(jí)，洋州三和化工有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，霍尼韋爾Burdick & Jackson公司）；磷酸（分析純，重慶川東化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鈉（分析純，重慶北碚化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；試驗(yàn)用水均為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.2.1 鹽酸依匹斯汀對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取鹽酸依匹斯汀對(duì)照品5 mg，用少量去離子水溶解后，再定容至50 mL，配成濃度為100 μg·mL-1的鹽酸依匹斯汀儲(chǔ)備液，取其儲(chǔ)備液用去離子水梯度稀釋至濃度分別為3.0、2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，冰箱（4 ℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取鹽酸地芬尼多對(duì)照品5 mg，用少量去離子水溶解后，再定容至50 mL，配成濃度為100 μg·mL-1的鹽酸地芬尼多儲(chǔ)備液，將鹽酸地芬尼多儲(chǔ)備液稀釋至濃度為10 μg·mL-1的工作液，冰箱（4 ℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉（27∶73，pH = 4.5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃。

2.3 血漿樣品處理

精密移取空白血漿1000 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，混勻后加入1 mol·L-1的NaOH溶液1000 μL和乙醚5 mL，旋渦提取10 min后，于9000 r·min-1條件下離心10 min，準(zhǔn)確吸取有機(jī)相于離心管中，室溫下氮?dú)獯蹈伞堅(jiān)尤肓鲃?dòng)相200 μL，旋渦振蕩10 min，離心后取上清液50 μL進(jìn)樣。

2.4 給藥方案及安全性評(píng)價(jià)

男性受試者20例，年齡18 ～ 28歲，身高160 ～185 cm，BMI 19 ～ 24 kg·m-2，并經(jīng)血壓、心率、肝腎功能、血尿常規(guī)和心電圖檢查證實(shí)為健康受試者。合格受試者要求無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝腎、消化道、肺及過(guò)敏性疾病病史，在試驗(yàn)前1個(gè)月內(nèi)未服用其它藥物，試驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)未參加已批準(zhǔn)的藥物臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)期間不飲用茶、酒和含咖啡因的飲料且禁止吸煙。受試者入組后根據(jù)臨床常規(guī)用量確定服藥劑量為含主藥鹽酸依匹斯汀40 mg，以溫開(kāi)水200 mL送服。服藥前12 h禁食，于次日清晨空腹給藥，2 h后可飲水，3.5 h后統(tǒng)一用餐。分別于給藥前和給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h抽取上肢靜脈血4 mL，肝素抗凝后分離血漿，于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)。本研究方案經(jīng)由第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意（臨審第2007006號(hào)）。

受試者在試驗(yàn)前簽署知情同意書(shū)，并在試驗(yàn)期間統(tǒng)一進(jìn)食，清淡飲食，研究醫(yī)生在給藥前后通過(guò)詢(xún)問(wèn)和受試者主動(dòng)報(bào)告的方式記錄不良反應(yīng)，并于試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)受試者進(jìn)行常規(guī)的體格檢查以及實(shí)驗(yàn)室檢查。

2.5 方法的專(zhuān)屬性

在210 nm紫外檢測(cè)條件下，鹽酸依匹斯汀和內(nèi)標(biāo)鹽酸地芬尼多均有較好的響應(yīng)，本試驗(yàn)考察了6個(gè)不同來(lái)源的健康人空白血漿，獲得空白血漿樣品圖譜；將含藥血漿按照“2.3”項(xiàng)下操作后進(jìn)行分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿圖譜及受試者口服藥物后的含藥血漿圖譜；比較空白血漿與含藥血漿圖譜，考察方法的專(zhuān)屬性，詳見(jiàn)圖1，顯示待測(cè)物鹽酸依匹斯汀與內(nèi)標(biāo)物鹽酸地芬尼多峰形良好，且能夠與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)分離完全，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為7.4 min和12.3 min。

圖1 高效液相色圖譜A - 空白人血漿，B - 40 ng·mL-1鹽酸依匹斯汀血漿樣品，C - 服藥1.5 h后受試者血漿樣品；1 - 鹽酸依匹斯汀，2 - 內(nèi)標(biāo)鹽酸地芬尼多Fig 1 HPLC chromatogramA - blank human plasma, B - blank plasma spiked with EPST at 40 ng·mL-1, C - plasma sample from volunteer 1.5 h after oral administration; 1 - epinastine hydrochloride, 2 - internal standard difenidol hydrochloride

2.6 校準(zhǔn)曲線樣品制作

取已配制好的鹽酸依匹斯汀各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL，加入950 μL空白血漿，渦旋混勻30 s后按“2.3”項(xiàng)下操作，配制成鹽酸依匹斯汀血漿濃度為5、10、20、40、60、80、100、150 ng·mL-1的系列溶液，每個(gè)濃度平行2份。記錄圖譜，以待測(cè)物鹽酸依匹斯汀與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）對(duì)藥物濃度（X）作線性回歸分析，并用最小二乘法計(jì)算得到回歸方程：Y= 0.012 7X- 0.019 4，r= 0.998 9，線性范圍5 ～150 ng·mL-1。

2.7 回收率和精密度

配制低、中、高濃度分別為5、40、100 ng·mL-1的鹽酸依匹斯汀質(zhì)控樣品，按“2.3”項(xiàng)下操作，測(cè)定峰面積，按回歸方程計(jì)算濃度，分別于同天不同時(shí)間段測(cè)定6次，以及每天測(cè)定6次連續(xù)測(cè)定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度和方法回收率。結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示人血漿中鹽酸依匹斯汀的日內(nèi)精密度RSD ＜ 8.17%，日間精密度RSD ＜ 8.83%，方法回收率在101.4% ～106.2%，均符合試驗(yàn)要求。

表1 鹽酸依匹斯汀精密度和回收率. n = 5Tab 1 Precision and recovery rate of epinastine hydrochloride. n = 5

2.8 樣本穩(wěn)定性

筆者分別考察了含藥血漿樣品在室溫放置24 h、待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液4 ℃冰箱放置40 d、-80 ℃冰箱凍存放置29 d、3次凍融循環(huán)條件下的穩(wěn)定性。

儲(chǔ)備液穩(wěn)定性考察是將待測(cè)物鹽酸依匹斯汀和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于0、1、2、3、5、7、14、21、40 d從冰箱取出后稀釋至0.8 μg·mL-1和1 μg·mL-1待測(cè)液測(cè)定其峰面積并觀察穩(wěn)定性。含藥血漿穩(wěn)定性考察是將待測(cè)物配制成低、中、高濃度的質(zhì)控樣品（5、40、100 ng·mL-1），經(jīng)過(guò)不同條件和時(shí)間放置后按照“2.3”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析。穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示待測(cè)物鹽酸依匹斯汀和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品在4 ℃冰箱至少可放置40 d（RSD ＜13.7%）；血漿樣品在室溫下至少可放置24 h（RSD ＜11.5%）；-80 ℃冰箱凍存至少可放置30 d（RSD ＜11.31%）；凍融循環(huán)三次后仍穩(wěn)定（RSD ＜ 8.35%）。

表2 鹽酸依匹斯汀穩(wěn)定性考察. n = 3Tab 2 Stability data of epinastine hydrochloride. n = 3

2.9 藥代動(dòng)力學(xué)和安全性評(píng)價(jià)

20例男性成人健康受試者口服鹽酸依匹斯汀分散片40 mg后，采用HPLC-UV法測(cè)定人血漿中鹽酸依匹斯汀濃度，所得數(shù)據(jù)經(jīng)BECS軟件（上海宏能軟件有限公司）統(tǒng)計(jì)分析。人體內(nèi)平均血藥濃度-時(shí)間均數(shù)曲線見(jiàn)圖2，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，成年人口服鹽酸依匹斯汀約（2.18±1.05）h達(dá)血藥峰值濃度，血漿濃度消除半衰期為（8.77±4.19）h。整個(gè)試驗(yàn)階段在醫(yī)護(hù)人員的監(jiān)控下進(jìn)行，受試者在試驗(yàn)期間無(wú)退出和脫落病例，依從性較好。未發(fā)生不良反應(yīng)，說(shuō)明本品在試驗(yàn)劑量下安全性較好。

圖2 鹽酸依匹斯汀血藥濃度-時(shí)間曲線圖. n = 20Fig 2 Blood concentration-time profile of epinastine hydrochloride. n = 20

表3 口服鹽酸依匹斯汀分散片后主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù). n = 20Tab 3 Pharmacokinetic parameters of epinastine hydrochloride after oral administration. n = 20

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)物選擇

以往多數(shù)研究[7,9,10]選擇替硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，本試驗(yàn)根據(jù)內(nèi)標(biāo)物選擇原則，對(duì)多種標(biāo)準(zhǔn)品（含替硝唑）進(jìn)行了篩選，最后發(fā)現(xiàn)鹽酸地芬尼多與待測(cè)物分離較好，且內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)物均不受血漿內(nèi)源性物質(zhì)干擾，滿足紫外檢測(cè)的分離條件。

3.2 流動(dòng)相的選擇

在液相色譜檢測(cè)時(shí)常用的有機(jī)流動(dòng)相體系為甲醇和乙腈，而無(wú)機(jī)相的選擇往往是難點(diǎn)。因鹽酸依匹斯汀極性較強(qiáng)，在選擇無(wú)機(jī)相時(shí)，筆者首先考慮了去離子水，分別采用乙腈-水體系和甲醇-水體系進(jìn)樣對(duì)照，結(jié)果顯示在乙腈-水體系下柱壓較小，而甲醇的柱壓較大，在峰型差異較小的情況下，本試驗(yàn)選擇了柱壓較小的乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相。采用純水作為無(wú)機(jī)流動(dòng)相時(shí)，峰拖尾嚴(yán)重，且待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)分離效果差，故采用磷酸緩沖液進(jìn)行試驗(yàn)，首先磷酸在低波長(zhǎng)處無(wú)吸收，其次緩沖液可以控制流動(dòng)相pH值，改善分離效果和峰形。考慮到色譜柱的耐酸范圍及鹽酸依匹斯汀的性質(zhì)，分別考察了乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉體系在pH為3.5和4.5時(shí)分離的效果和峰型，結(jié)果顯示在pH = 4.5時(shí)，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰型較好，且不受空白血漿的干擾。

3.3 血漿樣品的處理

筆者曾嘗試用蛋白沉淀法處理血漿樣本，由于依匹斯汀在人體內(nèi)濃度較低，達(dá)到納克級(jí)，采用甲醇和乙醚作為蛋白沉淀劑時(shí)，待測(cè)物定量下限達(dá)不到要求。故考慮采用液液萃取的方法進(jìn)行血漿處理，萃取劑選擇了二氯甲烷和乙醚兩種有機(jī)溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用乙醚液液萃取再濃縮的方法，不僅能滿足定量下限的要求，也滿足回收率測(cè)定。

綜上，本文建立了HPLC-UV法測(cè)定人血漿中鹽酸依匹斯汀濃度，該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于臨床和實(shí)驗(yàn)室對(duì)鹽酸依匹斯汀的體內(nèi)血藥濃度檢測(cè)。本臨床試驗(yàn)中，20例受試者口服鹽酸依匹斯汀分散片40 mg后，達(dá)峰濃度Cmax、達(dá)峰時(shí)間Tmax、半衰期t1/2分別為：（56.74±14.19）ng·mL-1、（2.18±1.05）h、（8.77±4.19）h，這些參數(shù)與其他文獻(xiàn)報(bào)道[1,10]（口服40 mg劑量鹽酸依匹斯汀）的數(shù)據(jù)相似。且該藥在20例受試者體內(nèi)安全性和耐受性良好，無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生。