兩種檢測飼料中維生素A乙酸酯、維生素D3和維生素E測定方法的比較分析

司慧民，元雪湞，全曉萍，陳 薔，韓 立

（河南省獸藥飼料監察所，河南 鄭州 450008）

維生素是維持生命活動所必需的一類物質。隨著營養生理學研究的深入，人們對維生素在動物營養中的作用有了新的認識，開始注意到維生素的重要作用[1-2]。維生素在生物體內的含量很少，但不可或缺。當動物機體缺乏維生素時，動物的生長發育以及繁殖機能就會受到影響，缺乏嚴重時甚至會引起特殊疾病。雖然目前畜禽病臨床中典型的維生素缺乏癥并不多見[3-4]，但在生產實踐中添加維生素制劑可以提高動物的飼料轉化效率，促進發病畜禽康復。

維生素分為水溶性和脂溶性兩大類[5]。水溶性維生素因其在動物體內不能蓄積，所以短期超量危害甚微。但是脂溶性維生素能夠在動物體內蓄積，長期超量就會產生有害影響。維生素化學性質極其不穩定，容易受到金屬離子的影響從而發生氧化，在酸、堿和光照的環境中也易分解[6]，因此快速準確地測定飼料中維生素的含量對防止維生素缺乏癥、維生素中毒、維生素的穩定性以及制定合理的維生素加工工藝和儲存條件等具有重要意義。

維生素 A 乙酸酯（VA）、維生素 D3（VD3）和維生素E（VE）在飼料中被廣泛使用，其在飼料中的含量直接影響飼料的品質。現行的國家標準[7]是3種維生素檢測的單獨標準。采用傳統處理方法，包括皂化破壁、有機溶劑萃取、濃縮、色譜凈化、正相分離及質譜檢測等步驟[8-12]，涉及多次蒸發溶解，操作步驟復雜，費時費力，容易造成待測組分損失，導致測定結果偏低且重現性不好。本試驗旨在選擇可同時檢測出飼料中VA、VD3和VE的含量，并且具有靈敏度和準確度高、檢測速度快等特點的定量檢測方法，從而為飼料中VA、VD3和VE含量的測定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 飼料樣品。豬濃縮飼料1、2、3和豬預混合飼料1、2、3均系市場自購,樣品用鋼磨粉碎并過40目篩，置于塑料自封袋中，陰涼干燥保存備用。

1.1.2 主要儀器。Waters UPLC超高效液相色譜儀（二極管矩陣檢測器）（美國Waters公司）；超聲波清洗器（可調溫度20～80℃）（昆山市超聲儀器有限公司）；PL403IC型電子分析天平 （梅特勒上海有限公司）；超純水儀（美國 Millipore公司）；0.22μm有機系濾膜（天津津滕公司）。

1.1.3 主要試劑。甲醇（色譜純，上海安譜）；氨水（分析純，天津科密歐）；乙醚（優級純，天津科密歐）；L-抗壞血酸（優級純，阿拉丁）；堿性蛋白酶（酶活力每克大于4000單位）；維生素A乙酸酯(純度≥99.0%，中國食品藥品檢定研究院)；膽鈣化醇（純度≥99.0%，First Standard）；dl-α-生育酚乙酸酯（純度≥99.0%，中國食品藥品檢定研究院）。

1.2 試驗設計

將處理好的豬濃縮飼料1、2、3和豬預混合飼料1、2、3分別按照快速測定法和國標方法進行樣品處理，并分別測定其中VA、VD3和VE的含量，每種飼料樣品在使用2種測定方法測定時分別設置3個平行。

1.3 試驗方法

1.3.1 快速測定法。溶液的配制。氨水溶液：取水適量，用氨水調節pH值為8～10；標準儲備溶液：分別準確稱取VA（維生素A乙酸酯，純度≥99.0%）標準品34.4mg（精確至 0.00001g）、VD3（膽鈣化醇，純度≥99.0%）標準品 10.0mg（精確至 0.00001g）、VE（dlα-生育酚乙酸酯，純度≥99.0%）標準品50.0mg（精確至0.00001g）于100mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，-18℃避光保存，有效期為6個月；混合標準儲備溶液：分別吸取VA、VD3和VE標準儲備溶液0.2、0.1、1.0mL于10mL棕色容量瓶，用甲醇稀釋并定容，冷凍避光保存，有效期為2周。

樣品前處理。稱取適量試樣（復合預混合飼料3g，維生素預混合飼料0.3g，濃縮飼料5～10g）精確至0.0001g，置于150mL的棕色錐形瓶中，加入15mL氨水溶液（pH值為8～10）（必要時加入吡咯啶二硫代甲基羧酸銨0.5g）振搖2min，再加入0.2g堿性蛋白酶于55～65℃水浴中超聲溶解20min（其間搖動3～5次），取出放入冷水浴中降溫，待降至室溫后加入25mL甲醇（分析純），常溫超聲提取15min（其間搖動2～3次），取出，轉移至50mL離心管中，10000r/min離心5min，將上清液轉移至100mL棕色容量瓶中，殘渣用30mL甲醇（分析純）重復提取1次，合并2次上清液，用甲醇定容至刻度。過0.22μm濾膜，上機測試。

色譜測定。色譜條件：色譜柱：C18柱（柱長100mm；內徑 1.7mm；粒度 1.7 μm）；流動相：甲醇+水=95+5；流速：0.3mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；檢測波長：325nm（0～4.0min）；265nm（4.1～7.0min）；280nm（7.1～12min）。

定量測定。在儀器正常工作條件下，取試樣溶液和相應的標準工作溶液上機進樣，作單點或多點校準，以色譜峰面積定量。標準工作溶液和試樣溶液中VA、VD3和VE的峰面積均應在儀器檢測的線性范圍內。在試樣液進樣過程中應參考標準工作液，以便定性定量準確。

1.3.2 國標方法。VA、VD3和VE的國標方法測定、試劑配制和樣品處理及色譜條件詳見對應國家標準[13-15]。

1.4 數據分析

對測定結果使用SPSS22.0統計學軟件進行統計分析，每種樣品2種測定方法間的比較采用數據樣本t檢驗法，6種樣品整體間的比較采用配對數據的t檢驗法，數據以"平均數±標準差"表示。

2 結果與分析

2.1 標準溶液色譜圖

圖1為快速測定法測定飼料中VA、VD3及VE定量測定過程中混合標準溶液的色譜圖；圖2、圖3和圖4為國標方法測定飼料中VA、VD3、VE的圖譜。由上圖可以看出，快速測定法可以實現液相色譜上機1次測定出飼料中VA、VD3、VE的含量，國標方法液相色譜上機3次才能測定出飼料中VA、VD3、VE的含量。

圖1 VA、VD3、VE混合標準溶液色譜圖

圖2 VA標準溶液色譜圖

圖3 VD3標準溶液色譜圖

圖4 VE標準溶液色譜圖

2.2 VA、VD3及VE的含量測定

使用2種方法對6種預混合飼料和濃縮飼料進行檢測，所得VA、VD3和VE含量結果見表1～表4。由表可知，6種飼料中VA、VD3及VE的含量使用快速測定法所得結果均高于國標方法；利用快速提取法測得3號豬濃縮飼料中VA和VE含量以及3號豬預混合飼料中VD3和VE含量均顯著高于國標方法（P<0.05）；整體比較分析結果顯示，利用快速測定法測定豬濃縮飼料中VA的含量顯著高于國標方法（P<0.05），豬預混料使用2種測定方法所得3種維生素含量差異均不顯著（P>0.05）。

表1 豬濃縮飼料中VA、VD3及VE含量的測定

表2 豬預混合飼料中VA、VD3及VE含量的測定

表3 豬濃縮飼料VA、VD3及VE含量測定結果的整體比較

表4 豬預混合飼料VA、VD3及VE含量測定結果的整體比較

3 討論

采用傳統國標方法測定飼料中VA、VD3和VE時，需按照3種維生素對應的國標方法[13-15]分別提取3次，再使用高效液相色譜儀在不同的色譜條件下進行3次上機測定，該方法耗時長，步驟復雜，容易造成被測組分的損失，影響準確度。快速測定法可在15min內完成3種維生素的提取，并且VA、VD3和VE的含量在高效液相色譜儀上上機1次即可測得。快速測定法優化了提取步驟，使得飼料中VA、VD3和VE在提取的過程中損失減少。因此，快速測定法更加高效便捷。

從快速測定法和國標方法提取飼料中VA、VD3和VE的結果來看，快速測定法比國標方法測得結果的平均值大，可能是因為快速測定法提取步驟的優化減少了提取過程中被測組分的損失，從而獲得比國標方法更準確、更可信的數據，故快速測定法較國標方法具有更高的靈敏度和準確度。

4 結論

快速測定法具有快速、準確和靈敏的特點，適合對飼料中VA、VD3和VE多組分一次性定量檢測。