Let?7b靶向抑制樹突狀細胞Bach1通過激活HO?1調控腸黏膜的損傷修復

田元元 覃曉日 田閣 符雪婷 孫曉寧

1海南省人民醫院（海南醫學院附屬海南醫院）消化內科（海口 570311）；3海南醫學院第二附屬醫院（海口 570216）；2北京市先農壇體育運動技術學校科研科（北京 100050）；4海南醫學院（海口 571199）

炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）是一種由潛在的免疫失調誘導的特發性、慢性、復發性炎癥狀態，包括兩種主要的臨床形式：潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn′s disease，CD）[1-2]。IBD已成為一種全球性疾病，其發病率不斷增加，目前影響著北美、歐洲、南美、中東和亞洲越來越多的人群[1-3]。盡管已建立了標準的治療方法，例如抗腫瘤壞死因子抗體治療[3-4]，但目前尚未完全明確導致IBD的潛在因素和機制。仍需要進一步的科學實驗研究來探索IBD發展機制，從而為IBD的新療法和藥物靶點提供新的視角。

血紅素加氧酶 1（heme oxygenase?1，HO?1）是一種抗氧化反應元件依賴性基因，具有抗氧化和抗炎功能[5-6]。HO?1的轉錄被則被另一種關鍵轉錄因子TB和CNC同源性1（TB and CNC homology 1，Bach1）通過結合前者增強子中多個Maf識別元件所抑制[7]。而且，HO?1的表達則需要 Bach1失活或被抑制[8]。但Bach1是如何失活的仍不清楚。以前的研究報道，在IBD條件下，HO?1水平上調[5]。已知樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是最重要的抗原提呈細胞。其在固有免疫和獲得性免疫應答的調節中都起到重要作用，能夠介導IBD炎癥反應或者參與免疫耐受，而且Bach1/HO?1通路能夠密切調控 DCs[9]。然而，在 DCs中的 Bach1和HO?1如何參與調控IBD并不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的小單鏈RNA，其長度通常在21～25個核苷酸之間。眾所周知，miRNA通過使用種子序列靶向mRNA的 3′非翻譯區（3′?UTR）來抑制基因表達，最終導致靶向mRNA的降解或靶向蛋白質的抑制[10-11]。因此，miRNAs在轉錄或轉錄后水平調節基因表達中起關鍵作用[12]。不僅如此，miRNA還廣泛參與多種生理和病理過程[13]。miRNA的失調導致包括IBD在內的多種疾病的發展和進展[14]。Let?7 miRNA家族是最早在秀麗隱桿線蟲中發現的兩個miRNA之一，是第一個已知的人類miR?NA，由 Let?7a、b、c、d、e、f、g、i和 miR?98 miRNA 組成。Let?7家族已被發現可在人類腸道發育和腸癌、腸炎中發揮重要作用[15]。而且最新研究顯示Let?7b在CD中參與調控了巨噬細胞的免疫功能并抑制了炎癥[16]。由于Let?7、HO?1、Bach1在IBD發病機制中均扮演關鍵角色，因此，本研究旨在觀察DSS誘導的IBD小鼠模型中HO?1和Bach1的表達，隨后利用生物信息學篩選了抗炎miRNA Let?7b作為DCs細胞中調控Bach1的關鍵上游基因。探討Let?7b是否介導DCs中Bach1的失活來促進HO?1表達，是否對結腸黏膜上皮細胞的損傷修復發揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠DCs細胞DC2.4購于長沙豐暉生物。小鼠結腸黏膜上皮細胞MCEC購于上海青旗生物技術有限公司。C57BL/6小鼠購自海南藥物研究所有限責任公司。胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。DMEM培養基購于美國Invitrogen公司。Trizol試劑購于美國Sigma公司。TaqMan miRNA探針購于美國Applied Biosystems公司。SYBR Green染料購于美國Ambion公司。ChamQ SYBR qPCR Master Mix購于中國Vazyme公司。鹽酸表小檗堿（Epiber?berine Chloride，EC）和鋅原卟啉（zinc protoporphy?rin，ZnPP）購于美國sigma公司。PMSF和RIPA裂解緩沖液購于上海Beyotime公司。購于BCA蛋白質測定試劑盒購于美國Thermo Scientific公司。pMIR?report熒光素酶載體購自美國Ambion公司。EdU原位細胞增殖試劑盒購于美國RiboBio公司。Let?7b擬似物、Let?7b擬似物陰性對照、Let?7b 抑制劑、Let?7b抑制劑陰性對照購于上海吉瑪公司。蘇木素?伊紅（HE）染色試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。螢光素酶測定試劑盒購于美國Promega Madison公司。

1.2 方法

1.2.1 葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠模型和病理分析所有用于實驗的12只6周齡C57BL/6小鼠均在無特定病原體條件下飼養，小鼠進行自由攝入嚙齒類動物食物并自由取水，本研究中動物實驗均經我院倫理委員會審批通過。為建立結腸炎小鼠模型，用隨機數字表法將12只C57BL/6小鼠隨機分為正常組和模型組2組，每組6只。模型組的干預方法是在小鼠的飲用水中加入了3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS），小鼠自由飲水和攝食，持續飲水7 d。給予正常組小鼠正常飲水（飲水中不加入任何藥物），持續7 d。在整個造模期間每天監測模型組和正常組小鼠的體重。疾病活動度（disease activity index，DAI）評分按照DAI=體質量下降分數＋大便性狀分數＋便血情況分數）/3進行計算。

實驗結束后處死小鼠。收集這2組腸道組織，即選取模型組中清潔后的病變明顯的新鮮腸組織約1.0 cm，正常組則按照模型組取樣位置取同節段的新鮮腸組織1.0 cm。2組中剪0.5 cm組織用于 Let?7b的表達分析和Bach1及 HO?1蛋白表達的分析。其余腸組織置于4%甲醛溶液中固定，然后進行石蠟包埋及切片，最后根據HE染色試劑盒提供的說明進行結腸組織HE染色分析其病理情況。組織病理學評分=上皮損傷＋損傷程度。

1.2.2 小鼠DCs細胞的培養、瞬時轉染以及蛋白抑制劑處理37℃溫度下，在含5% CO2的濕潤空氣環境中將DC2.4細胞培養于補充有10%FBS的DMEM培養基，并同時添加青霉素（100 U/mL）和鏈霉素。細胞培養1～2 d更換新鮮培養基，3 d傳代1次，DC2.4細胞生長至對數生長期用于Bach1強效抑制藥鹽酸表小檗堿（epiberberine chloride，EC）、HO?1特異性抑制劑鋅原卟啉（zinc protopor?phyrin，ZnPP）的干預，以及 Let?7b 擬似物或 Let?7b抑制劑的瞬時轉染。

將DC2.4細胞共分為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組，共7組：（Ⅰ）空白對照組（細胞不進行任何藥物干預）；（Ⅱ）Let?7b擬似物陰性對照組（用Lipofectamine 2000試劑，將2 nmol/L的Let?7b擬似物陰性對照序列轉染細胞24 h）；（Ⅲ）Let?7b擬似物轉染組（用Lipofectamine 2000試劑，將2 nmol/L的Let?7b擬似物轉染細胞24 h）；（Ⅳ）Let?7b抑制劑陰性對照組（用Lipofectamine 2000試劑，將2 nmol/L的Let?7b抑制劑陰性對照序列轉染細胞24 h）；（Ⅴ）Let?7b抑制劑轉染組（用 Lipofect?amine 2000試劑，將 2 nmol/L 的 Let?7b抑制劑轉染細胞24 h）；（Ⅵ）Let?7b抑制劑聯合EC干預組（將2 nmol/L的 Let?7b抑制劑序列和 20 μg的 EC聯合處理DCs 24 h）；（Ⅶ）Let?7b抑制劑、EC、ZnPP三種藥物共處理干預組（將2 nmol/L的Let?7b抑制劑序列、20 μmol/L 的 EC、6 μmol/L 的 ZnPP 聯合處理DCs 24 h）。細胞干預結束，收集各組DCs和培養物上清液用于實驗研究。

1.2.3 RNA分離和定量RT?PCR（qRT?PCR）用Trizol試劑分離1.2.1中留取的腸組織中的總RNA以及1.2.2中各組DC2.4細胞及細胞培養物上清液中的總RNA。使用SYBR Green以及特異性引物定量各組腸組織和各組DC2.4細胞中的Let?7b，并定量DC2.4細胞培養物上清液中的Bach1和HO?1 mRNA。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix進行逆轉錄PCR和定量RT?PCR（qRT?PCR）。在qRT?PCR反應后，循環閾值（CT）數據被標準化，miRNA的內參基因為U6和，mRNA的內參基因為GAPDH。計算公式包括：△△CT=（CT miRNA-CT U6）觀察組-（CT miRNA-CT U6）對照組；△△CT=（CT mRNA-CT GAPDH）觀察組-（CT mRNA-CT GAPDH）對照組，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 蛋白提取和蛋白免疫印跡（Western blot，WB）使用補充有苯甲基磺酰氟（phenylmethane?sulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解緩沖液提取1.2.1中留取的腸組織中的總蛋白以及1.2.2中各組DC2.4細胞培養物上清液中的總蛋白，所有組的蛋白濃度使用BCA蛋白質測定試劑盒進行定量。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodi?um dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS?PAGE）分離蛋白，通過濕轉法將電泳膠上的蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜上，膜在含5%脫脂奶粉和0.1%吐溫?20的PBS中封閉，然后與一抗在4℃孵育過夜。一抗稀釋倍數和抗體信息如下：Bach1（ab49657，1∶1 000，abcam），HO?1（#43966S，1∶1 000，Cell Signaling Technology），磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde?phosphate dehydrogenase，GA?PDH）（sc?25778，1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology）。然后將膜與IgG二抗（稀釋1∶10 000）孵育1 h。用柯達1DV3.6計算機成像系統進行各條帶的相對灰度值測定，內參蛋白為GAPDH。

1.2.5 螢光素酶基因報告實驗pMIR?report熒光素酶載體購自Ambion。將含有Let?7b結合位點的Bach1 3?′UTR并克隆到pMIR?report熒光素酶載體中以構建野生型（WT）螢光素酶質粒。轉染螢光素酶報告質粒的DC2.4細胞分別與Let?7b擬似物或Let?7b抑制劑共轉染。然后使用螢光素酶測定試劑盒測定熒光強度。

1.2.6 Edu法檢測小鼠結腸黏膜上皮細胞的增殖利用48孔培養板觀察MCEC細胞的增殖。48孔板中首先分別加入1.2.2中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組的DC2.4細胞的培養物上清液各150 μL，隨后接種100 μL含2 × 105/mL對數生長期的MCEC細胞，培養基為含10% FBS的DMEM。以觀察不同處理的DCs的培養液對MCEC細胞增殖的影響。培養體系置于溫度為37℃含5% CO2的濕潤培養箱中，培養24 h。隨后去掉原培養基，將各組處理好的MCEC細胞按照試劑盒說明加入到EdU原位細胞增殖試劑中孵育2 h，按照方案說明，用熒光顯微鏡捕捉細胞的核，并測定Edu陽性細胞的比例。

1.2.7 小鼠結腸黏膜上皮細胞的傷口愈合試驗利用48孔培養板觀察MCEC細胞的增殖。48孔板中首先分別加入1.2.2中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組的DC2.4細胞的培養物上清液各150 μL，隨后接種100 μL含2 × 105/mL對數生長期的MCEC細胞，培養基為含10% FBS的DMEM。培養體系置于溫度為37℃含5% CO2的濕潤培養箱中，在培養6 h時在每個孔的中軸線上劃痕，并在劃痕后0 h和24 h拍攝后計算劃痕的寬度和傷口愈合率。

1.3 統計學分析本研究數據使用（）表示。用SPSS軟件統計本研究中各組數據的分布和差異顯著性。初步分析的結果為正態分布。正常組和模型組2組中基因表達差異的分析使用t檢驗。Ⅰ～Ⅶ組的細胞實驗數據之間的差異使用單因素方差分析，存在差異后的兩兩比較采用LSD?t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。實驗至少重復3個批次，均得到一致的結果。所有實驗包括每個處理組至少3個重復的樣本。

2 結果

2.1 Bach1和HO?1在IBD結腸炎炎癥組織中的表達通過給予小鼠3%DSS 7 d構建了結腸炎小鼠模型，使用WB法檢測模型組和正常組中Bach1和HO?1的表達情況。結果，與正常組的腸組織相比，模型組中的Bach1顯著下調，而HO?1的表達明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1A?C。

圖1 DSS誘導的結腸炎小鼠炎癥組織中Bach1和HO?1的表達Fig.1 Expression of Bach1 and HO?1 in the inflammatory tissue of DSS?induced colitis mice

以DAI評分、HE染色、組織病理學評分綜合判斷小鼠IBD結腸炎模型是否建立成功。首先大體觀測發現正常組小鼠的狀態活躍且健康，體質量未見減輕。而模型組所有小鼠欠活躍，體質量持續減輕，而且給予3%DSS 3 d小鼠均出現肉眼便血和大便不成形現象，DSS 7 d模型組所有小鼠均出現無糞質排便，而僅有鮮血。另外，正常組DAI評分7 d內不高于1分。而模型組2～7 d DAI的評分依次達到（1.52±0.15）、（2.11±0.32）、（2.48 ± 0.22）、（2.72 ± 0.44）、（3.16 ± 0.30）、（3.73±0.17）。正常組和模型組的結腸組織的HE染色圖片在光鏡下對比明顯，正常組未見炎癥浸潤的細胞，且組織結構完好，上皮形態致密。模型組則出現黏膜水腫、免疫細胞浸潤、隱窩扭曲且隱窩顯著減少，組織結構破壞嚴重。而且模型組的組織病理學評分達到（8.48±0.57），正常組為（0.76±0.06）。表明DSS成功誘導IBD結腸炎小鼠模型，造模成功率100%，DSS誘導7 d內小鼠病死率為0%。見圖1D-E。

2.2 DCs中過表達Let?7b抑制Bach1并促進HO?1分泌DCs中過表達或沉默Let?7b后對細胞培養物上清液中Bach1表達的影響。結果顯示Let?7b過表達明顯抑制DCs培養物上清液中Bach1蛋白表達水平，而Let?7b沉默促進Bach1表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。Let?7b過表達明顯促進了細胞培養物上清液中HO?1的表達而沉默則抑制了細胞培養物上清液中HO?1的表達，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2A?C。還檢測了結腸炎小鼠腸組織中Let?7b的表達水平，與正常組（1.00±0.06）比，模型組（4.26 ± 0.39）Let?7b的表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。應用Pearson相關分析來研究Bach1和HO?1與Let?7b之間的關系。如圖所示，結腸炎小鼠中Let?7b的表達與Bach1呈負相關，而 Let?7b與 HO?1呈正相關，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2D-E。

圖2 Let?7b對DCs培養物上清液中Bach1和HO?1表達的影響Fig.2 Effect of Let?7b on Bach1 and HO?1 expression in DCs culture supernatant

2.3 Let?7b通過直接與Bach1的3′?UTR結合通過生物信息學方法分析出Let?7b潛在的靶基因基因為Bach1。因此，在這部分進一步研究了Bach1是否被Let?7b靶向負調控。生物信息學分析揭示了Let?7b和 Bach1的 3′?UTR 處的潛在結合位點。為證明 Let?7b 在 Bach1 3′?UTR 處的直接結合，在DC2.4細胞過表達（Let?7的模擬物）和抑制Let?7的條件下進行了熒光素酶報告基因測定。發現熒光素酶活性是受Let?7過表達的負調控，受Let?7抑制的正調控。結果表明，Let?7b過表達時熒光素酶活性顯著降低，而Let?7b沉默組的熒光強度明顯增強，見圖3。

圖3 Let?7b與Bach1的3′?UTR直接結合Fig.3 Direct binding of Let?7b to the 3′?UTR of Bach1

2.4 Let?7b通過抑制Bach1并促進HO?1分泌增加結腸黏膜上皮細胞的增殖和傷口愈合見圖4和表2，DCs中過表達Let?7b顯著抑制培養物上清液中Bach1的mRNA水平，并提高了培養物上清液HO?1 mRNA水平和結腸黏膜上皮細胞的Edu陽性率（P＜ 0.05），當沉默Let?7b時培養物上清液中Bach1的mRNA水平增加（P＜0.05），而結腸黏膜上皮細胞的Edu陽性率明顯降低（P＜0.05）。另外，根據實驗結果，沉默Let?7b可促進靶基因Bach1的表達，而在此基礎上抑制Bach1則可大幅度恢復結腸黏膜上皮細胞的Edu陽性率（P＜0.05），而繼續加入HO?1抑制劑則Edu陽性率又降低（P＜0.05），而研究結果還顯示，HO?1抑制劑明顯抑制了HO?1 mRNA（P＜0.05），而Bach1的mRNA水平不受HO?1抑制劑的影響（P＞0.05）。

圖4 Let?7b體外抑制Bach1調控HO?1的分泌促進結腸黏膜上皮細胞的增殖Fig.4 Let?7b inhibits Bach1 and regulates HO?1 secretion to promote proliferation of colonic mucosal epithelial cells in vitro

表2 Let?7b抑制Bach1的分泌從而促進HO?1分泌增加MCEC細胞的Edu陽性率Tab.2 Let?7b inhibited Bach1 secretion and promoted HO?1 secretion to increase Edu positive rate of MCEC cells±s

表2 Let?7b抑制Bach1的分泌從而促進HO?1分泌增加MCEC細胞的Edu陽性率Tab.2 Let?7b inhibited Bach1 secretion and promoted HO?1 secretion to increase Edu positive rate of MCEC cells±s

注：與Ⅰ組比，aP ＜0.05；與Ⅱ組比，bP ＜0.05；與Ⅳ組比，cP ＜0.05；與Ⅴ組比，dP ＜0.05；與Ⅵ組比，eP ＜0.05

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組Ⅴ組Ⅵ組Ⅶ組F值P值Edu陽性率（%）84.63±4.05 85.02±3.63 92.25±2.38ab 85.13±4.72 26.43±2.71ac 71.02±5.24ad 27.14±4.06ae 85.663 0.021 Bach1 mRNA相對表達水平1.00±0.03 0.99±0.08 0.14±0.01ab 1.00±0.03 8.39±1.22ac 0.09±0.02ad 0.10±0.01ad 208.211＜0.001 HO?1 mRNA相對表達水平1.00±0.02 0.99±0.05 13.58±1.27ab 0.99±0.08 0.35±0.02ac 14.04±0.74ad 0.07±0.01ade 352.450＜0.001

進一步研究DCs中 Let?7b調控Bach1 和 HO?1在培養物上清液中的表達從而對結腸黏膜上皮細胞傷口愈合率的影響。結果如圖5顯示，Let?7b過表達提高結腸黏膜上皮細胞傷口愈合率，而當沉默Let?7b時結腸黏膜上皮細胞的傷口愈合率明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。另外，根據實驗結果，與單獨沉默 Let?7b組比，沉默Let?7b聯合Bach1抑制劑則可明顯恢復傷口愈合，差異有統計學意義（P＜0.05），而繼續加入HO?1抑制劑傷口愈合率則被抑制（P＜0.05），表明，Bach1是Let?7b調控結腸黏膜上皮細胞增殖和傷口愈合的直接調控靶點，HO?1是 Let?7b/Bach1軸調控結腸黏膜上皮細胞增殖和傷口愈合的下游靶點。

圖5 Let?7b抑制Bach1從而調控HO?1的分泌促進結腸黏膜上皮細胞的傷口愈合Fig.5 Let?7b inhibits Bach1 and regulates HO?1 secretion to promote wound healing in colonic mucosal epithelial cells

3 討論

本研究中，觀察了DSS誘導的IBD小鼠模型中HO?1和Bach1的表達。利用生物信息學篩選出一種靶向Bach1的關鍵抗炎miRNA Let?7b。為研究Let?7b簇對HO?1的潛在調節作用，綜合使用熒光素酶報告基因檢測、基因表達檢測、沉默和過表達目標miRNA等策略結合蛋白免疫印跡實驗和細胞增殖和傷口愈合實驗。最終證實Let?7b恰好通過與Bach1的3′?UTR的結合來抑制Bach1的表達。在體外進一步證實Let?7b/Bach1/HO?1這一條潛在調控軸。最后使用DCs培養物上清液和結腸黏膜上皮細胞共培養，經過Edu細胞增殖實驗和細胞傷口愈合實驗得出，Let?7b在結腸黏膜上皮細胞增殖和損傷修復中的保護作用。總之，本研究揭示Let?7b/Bach1/HO?1軸的差異表達在保護腸黏膜炎癥不受損傷中起到重要作用，并為IBD治療提供了潛在的治療靶點。

IBD是一種與強烈氧化應激損傷相關的自身免疫性疾病[17]。由腸上皮屏障驅動的腸黏膜免疫失衡可能是IBD的病因之一。IBD的主要免疫調控角色是DCs、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞。其中DCs是免疫系統中最有效的抗原呈現細胞，然而DCs在IBD條件下是如何發揮作用，以及受何種機制調控并不十分明確。已知DCs在IBD黏膜中會表現出顯示促炎特性，從而推動IBD疾病進展[18]。另外，HO?1已被證實可以抑制DCs的成熟和促炎功能，Bach1可以抑制該功能[19-21]，暗示DCs在IBD中很可能也通過Bach1/HO?1軸發揮促炎和免疫調控功能。本研究中證實了IBD中Bach1的蛋白表達明顯升高，而HO?1的表達水平降低，而且在DCs中發現了一個新的機制即Let?7b可以靶向Bach1，導致DCs培養物上清液中Bach1的表達被抑制，反而促進了DCs培養物上清液中HO?1的表達。已知在IBD模型中，通過激活DCs促進炎癥因子表達，而姜黃素可以通過抑制DCs活性來改善實驗性腸炎的炎癥[22]。作為響應氧化應激的細胞保護程序的主要調節劑，通過激活HO?1等細胞保護酶對結腸炎具有顯著的保護作用[23]。研究表明，HO?1在結腸炎的活動性炎癥結腸中顯著升高，并保護腸黏膜屏障免受炎癥損傷和氧化應激，而且降低小鼠HO?1的水平可以增加對結腸炎相關結直腸癌的易感性[8，24]。然而，在炎癥過程中調節的機制仍然難以捉摸。正如本研究前言部分提到的，HO?1激活需要Bach1的失活[8]。因此目前需要闡明Bach1失活的原因。

miRNA是一類重要的轉錄后水平的基因表達調控因子，主要通過翻譯調控和mRNA的失穩發揮作用。在哺乳動物中，miRNAs被預測調節超過60%的蛋白編碼基因。Bach1是HO?1基因表達的重要抑制因子，而且 Bach1 的 3′?UTR（3313 nt）較長，這為推測miRNA結合提供了更大的機會。本研究中利用雙熒光素酶基因報告實驗證明了Let?7b與Bach1的3′?UTR的多個堿基結合，并在轉錄后水平直接抑制Bach1 mRNA和蛋白分泌到細胞外，隨后緩解Bach1介導的HO?1抑制。另一方面，在Let?7b誘導Bach1表達減少的前提下，可以直接刺激HO?1的啟動子啟動HO?1轉錄[8]。通過這兩種功能途徑，Let?7b/Bach1/HO?1 調節軸則極大增強了IBD炎癥過程中HO?1的表達水平。Let?7b過表達后的DCs培養物上清液可提高結腸黏膜上皮細胞的增殖活性和細胞傷口愈合，這歸功于Let?7b過表達抑制Bach1的分泌從而導致HO?1分泌增加或者大幅度激活。因為與Let?7b抑制劑單獨處理組比，Let?7b抑制劑聯合Bach1抑制劑共處理DCs后的培養物上清液能增強MCEC的增殖活性和傷口愈合能力，但 Let?7b、Bach1、HO?1三者抑制劑共處理DCs后的細胞培養物上清液則抑制了結腸黏膜上皮細胞的增殖活性并減弱了細胞傷口愈合能力。另外，還觀察到DCs細胞培養物上清液中Bach1水平不受HO?1抑制劑影響，但是Bach1抑制劑可以明顯促進DCs細胞培養物上清液中HO?1的水平。這進一步證實，HO?1是Let?7b/Bach1軸調控結腸黏膜上皮細胞增殖和傷口愈合的關鍵下游靶點，Let?7b則是Bach1表達減少的直接上游調控靶點。

然而，這項研究仍存在一些局限性。例如，考慮到實驗操作的可行性，只通過體外實驗開展DCs細胞培養物上清液對MCEC細胞增殖和傷口愈合實驗來驗證預測的結果，而沒有涉及動物體內的機制探討。在IBD的過程中，炎癥破壞了黏膜屏障，腸腔內的DCs等遞送抗原激活免疫細胞，進一步加劇了黏膜屏障的破壞。眾所周知，IBD的特點是腸黏膜上皮細胞的愈合能力受損，例如增殖和遷移功能受損[25]。本研究中DCs通過分泌關鍵基因從而影響了結腸黏膜上皮細胞的增殖和遷移功能，因為觀察到DCs中過表達Let?7b可通過抑制Bach1的分泌而促進HO?1在細胞培養物上清液中的表達，從而促進了結腸黏膜上皮細胞的增殖和遷移，這表明Let?7b參與了IBD進展中的腸黏膜損傷修復，涉及到DCs細胞和結腸黏膜上皮細胞形成的細胞環境系統。因此在本課題的后續實驗中，將深入探討IBD體內外環境中Let?7b/Bach1/HO?1軸在DCs?腸黏膜上皮系統中的關鍵調控作用和機制。

總之，在本研究中確定了DCs細胞中Let?7b靶向抑制Bach1并激活HO?1的分泌從而保護腸黏膜上皮細胞的增殖活性和傷口愈合活性。本研究擴展了Bach1/HO?1軸調節IBD過程的理解，并強調了Let?7b在IBD中的促再生和損傷修復作用。本研究將為IBD治療提供新的治療靶點。