恩諾沙星與氟苯尼考對中華鱉組織損傷的聯合毒性探究

張永剛，王 政，張凱璇，邢麗紅，吳 薇，李 靖，武寧寧，宋以柱，劉 瑩

(1.中國海洋大學化學化工學院，山東青島 266100；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島 266071；3.青島市海洋發展促進中心，山東青島 266071；4.青島市海洋管理保障中心，山東青島 266071；5.青島市漁業技術推廣站，山東青島 266071)

由于環境中多種抗生素低劑量、長時間混合暴露的特點，單一抗生素的生物學效應研究顯然不能滿足對抗生素生態毒理效應的正確全面評估，因此對抗生素進行聯合毒性研究勢在必行。目前，關于恩諾沙星和氟苯尼考對甲殼類動物、海洋細菌、輪蟲、海洋硅藻和魚類的毒性，恩諾沙星與磺胺二甲嘧啶的聯合毒性已有報道，但關于恩諾沙星和氟苯尼考的聯合毒性，及對兩棲動物(中華鱉)聯合暴露造成的毒性研究較少。本研究使用恩諾沙星與氟苯尼考配制成抗菌劑混合物，對中華鱉進行了低、中、高濃度(相當于每種藥物正常臨床劑量的1、3、5 倍)的毒理學研究，以期為抗菌劑混合物在中華鱉病害防控及獸醫臨床中的科學使用提供理論依據。

一、材料與方法

1.實驗動物 中華鱉由山東省平度百歲泊中華鱉養殖基地提供，體質量為(500±50)克/只。實驗前需進行物理和生化檢查，以確保所有實驗鱉無病無傷，體內無恩諾沙星和氟苯尼考藥物殘留，于給藥前停飼24小時。

2.藥品與試劑 恩諾沙星原料粉(純度≥98%，CAS：MFCD00792463)購自上海麥克林生化科技有限公司，氟苯尼考原料粉(純度≥99%，CAS：73231-34-2)購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司，無水乙醇、甲醛、冰乙酸、二甲苯均為分析純。

3.藥物配制 參考2015年版《中國獸藥典》《新編漁藥手冊》和《恩諾沙星水產養殖使用規范》(SC/T 1084-2007)用藥標準，氟苯尼考與恩諾沙星對魚的日推薦用藥劑量均為15 毫克/千克，因兩種藥物聯合使用，故每種藥物用量減半。使用0.9%生理鹽水將氟苯尼考原料粉與恩諾沙星原料粉分別配制成濃度為15、45、75毫克/毫升的藥液，即魚推薦劑量的1倍劑量(恩諾沙星7.5毫克/千克＋氟苯尼考7.5毫克/千克)、3倍劑量(恩諾沙星22.5 毫克/千克＋氟苯尼考22.5 毫克/千克)和5 倍劑量(恩諾沙星37.5 毫克/千克＋氟苯尼考37.5毫克/千克)(體質量計)。

4.實驗設計 實驗設3個實驗組(1倍、3倍及5倍劑量組)和1個對照組，均設3個平行，每個平行實驗鱉10 只。參照劉瑩等(2022)的方法，實驗組采用口灌給藥方式，用帶有橡皮軟管的注射器從中華鱉口中插入，灌喂抗菌劑混合物(恩諾沙星和氟苯尼考)藥液0.5 毫升。對照組口灌等量的無菌生理鹽水溶液。實驗共進行5 天，口灌1 次/天，實驗期間水溫為25～26℃。

5.樣品采集與組織切片處理 參照劉瑩等(2022)的方法，于停藥24 小時后，在對照組和口灌不同劑量抗菌劑混合物實驗組隨機取3只中華鱉于冰盤上進行解剖，采集肝臟、脾臟、心臟、腎臟、肌肉、腸道、睪丸和精巢組織樣本。參考張永剛(2019)的方法，對所有組織進行固定、切片、染色后，在顯微鏡下進行病理學分析。

二、實驗結果

1.腸道組織結構觀察 對照組腸黏膜結構清晰，黏膜細胞類型正常，腸絨毛結構完整(圖1-腸道A)。與對照組相比，1 倍劑量組腸絨毛出現孔隙，結構不完整(圖1-腸道B)。隨著口灌劑量的增加，3倍劑量組腸固有層結構皺縮，腸絨毛排列不整齊，出現脫落現象，細胞核H.E.染色加深(圖1-腸道C)；5倍劑量組黏膜層相融，結構模糊，固有層、中央乳糜管消失，腸腔內可見大量脫落的腸黏膜(圖1-腸道D)。

2.肝臟組織結構觀察 對照組肝細胞排列緊密，肝小葉、中央靜脈和匯管區結構正常(圖1-肝臟A)。與對照組相比，1倍劑量組肝靜脈血管壁增厚，中央靜脈出現炎性細胞(圖1-肝臟B)。隨著口灌劑量的增加，3倍劑量組可見肝血竇擴張，有大量血細胞浸潤(圖1-肝臟C)；5 倍劑量組肝細胞結構松散，肝靜脈血管壁繼續膨脹，血竇繼續擴張，竇壁破碎細胞散布于其中(圖1-肝臟D)。

3.腎臟組織結構觀察 對照組腎小球和腎小管清晰，腎小管排列整齊，腎細胞的細胞核和細胞質結構清晰(圖1-腎臟A)。與對照組相比，1 倍劑量組腎細胞間有大量血鐵紅素沉積，腎小球開始萎縮變形(圖1-腎臟B)。隨著口灌劑量的增加，3倍劑量組腎被膜內層平滑肌下有較多炎性細胞浸潤，細胞松散，H.E.染色逐漸變淺(圖1-腎臟C)；5倍劑量組腎細胞出現裂解現象，腎小管結構模糊甚至完全消失，細胞H.E.染色變淺(圖1-腎臟D)。

4.脾臟組織結構觀察 對照組脾組織細胞結構明顯，排列緊密(圖1-脾臟A)。與對照組相比，1 倍劑量組橢圓體鞘室內有紅細胞浸潤(圖1-脾臟B)。隨著口灌劑量的增加，3 倍和5 倍劑量組脾組織細胞松散，細胞略微空泡化，胞核固縮，H.E.染色加深，中央動脈內有炎性細胞浸潤(圖1-脾臟C、D)。

5.睪丸組織結構觀察 對照組觀察到曲細精管邊界線明顯，結構完好無損，其內充斥著大量的生精細胞(圖1-睪丸A)。與對照組相比，1 倍劑量組曲細精管內精子細胞開始減少(圖1-睪丸B)。隨著口灌劑量的增加，3 倍和5 倍劑量組睪丸實質內成熟精子細胞顯著減少，結構損傷嚴重，甚至出現空腔現象(圖1-睪丸C、D)。

6.精巢組織切片觀察 對照組精巢曲細精管腔結構清晰，精小囊內充斥著大量生殖細胞群體(圖1-精巢A)。與對照組相比，1 倍劑量組精小囊內生殖細胞逐漸減少(圖1-精巢B)。隨著口灌劑量的增加，3 倍和5 倍劑量組精巢組織受損嚴重，曲細精管腔壁腫脹，生精小管內成熟精子細胞嚴重減少，導致空腔現象出現(圖1-精巢C、D)。

7.心臟組織結構觀察 對照組心肌膜結構清晰，心肌纖維縱橫交叉，排列有序(圖1-心臟A)。與對照組相比，1倍劑量組胞核固縮、脫落，心肌纖維間浸潤大量的炎性細胞(圖1-心臟A、B)。隨著口灌劑量的增加，3 倍和5 倍劑量組心肌纖維排列紊亂、斷裂，結構破壞嚴重(圖1-心臟C、D)。

8.肌肉組織切片觀察 對照組、1 倍和3 倍劑量組，從縱切面對肌肉組織觀察，肌細胞形態正常，肌纖維緊湊，平行排列(圖1-肌肉A、C)；與對照組相比，5倍劑量組肌纖維間隙增大，出現溶解現象，肌細胞核固化，甚至消失(圖1-肌肉D)。

圖1 口灌抗菌劑混合物(恩諾沙星和氟苯尼考)對中華鱉組織的病理變化

三、討論

毒性數據是支持多種化學品風險評估的關鍵。Ding 等(2022)將泥鰍鰭細胞暴露于400、800、1 200 微摩/升恩諾沙星中，發現恩諾沙星抑制了細胞的增殖，產生細胞毒性。Qiu等(2020)以斑馬魚為研究對象，發現恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢噻吩和四環素單一或聯合用藥對其早期發育和代謝系統有顯著影響，且得出聯合用藥具有協同毒性的結論。以上研究可以看出，當特定藥物聯合使用時，可使毒性增加，并且會引起研究者對毒性的高度關注。

組織病理學提供了一個快速診斷，以檢測魚的各組織和器官在抗生素暴露后異常的方法。本實驗探究了聯合用藥(恩諾沙星與氟苯尼考)對中華鱉的影響發現，高(5倍)、中(3倍)和低(1倍)劑量聯合給藥，均可造成中華鱉腸道、腎臟、肝臟、脾臟、睪丸和精巢等組織器官不同程度的病理損傷。損傷程度與劑量有關，5倍劑量組對各組織結構影響最大。主要表現為腸黏膜層相融、結構模糊，肝臟組織結構松散、血竇擴張，腎細胞裂解、腎小管消失，睪丸和精巢組織中成熟精子細胞顯著減少，出現空腔現象，脾組織細胞空泡化、胞核固縮，有炎性細胞浸潤，心肌纖維排列紊亂、斷裂，肌肉肌纖維溶解、細胞核消失。Gaikowski 等(2013)在羅非魚飼料中添加15、45、75 毫克/千克劑量的氟苯尼考(氟苯尼考推薦劑量的1、3、5 倍)，口服20 天后對組織觀察發現，肝臟中糖原型和脂質型肝細胞空泡增加，淋巴細胞減少，腎小管上皮變性。Luan 等(2021)研究了恩諾沙星聯合黏菌素、喹烯酮對SPF 大鼠的短期毒性，發現聯合口服14 天后，可造成嚴重的肝組織損傷。上述結果與本研究一致。腸道、肝臟、脾臟、腎臟作為動物機體的抗氧化系統，組織中包含多種非特異性免疫酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等，它們能夠防止活性氧自由基引起的重要細胞損傷。當抗生素過量暴露或給藥后，刺激動物機體內源性活性氧自由基過度積累，例如超氧陰離子和過氧化氫，在不同組織中超出抗氧化能力來抵消，阻礙解毒反應，隨后引起組織脂質過氧化，誘導DNA 或RNA 損傷，進而增強抗生素對動物機體組織器官的毒性。

心臟為動物重要的循環系統器官，在血液循環和藥物運輸方面起到重要的作用，抗生素對血液成分產生影響，進而也會對心臟組織造成損傷。睪丸和精巢作為動物重要的生殖器官，過量使用抗生素，殘留藥物能在組織中積累，進而造成動物遺傳毒性。氟喹諾酮類和四環素類抗生素的混合物可以通過改變轉錄和蛋白質水平來引起斑馬魚幼體的免疫毒性和心臟損傷(Li 等，2016；Yin 等，2014)。以前對大鼠和狗的研究顯示，多次口服氟苯尼考后會使血液參數發生變化，肝體指數增加和睪丸萎縮(歐洲藥品管理局)。在本研究中也顯示出相同的毒性。一般來說，養殖魚大量口服抗生素后，機體會產生過量的活性氧自由基，導致染色體破裂、異常，破壞DNA 修復蛋白質的功能，從而誘發遺傳毒性和細胞凋亡。

四、小結

本研究表明，恩諾沙星和氟苯尼考聯用可使毒性增加，對中華鱉的各個組織器官均可造成嚴重的損傷，且聯合毒性具有劑量依賴性。高劑量的聯合毒性作用最強，毒性順序為：生殖器官＞排泄器官＞消化器官＞免疫器官＞循環器官。因此，在實際養殖疾病治療時，必須合理規范使用抗菌藥物，不可盲目增加給藥劑量，以免對動物機體造成嚴重損傷，產生較大的經濟損失。