低劑量超短波治療對大鼠脊髓損傷后TGF-β1、HIF-1α和Nogo-NgR通路的影響

李鵬程 趙 偉 張 洋 王 勇 包曉赫 董 宇 王 楠

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是世界上最嚴重的神經系統疾病之一，通常會導致嚴重的長期殘疾，給社會帶來了沉重的經濟負擔[1]。據世界衛生組織(WHO)估計，全球每年有超過25萬人患有脊髓損傷，且發生率仍在上升[2]。SCI患者功能恢復的常規干預措施包括藥物和手術等康復方法，但治療效果仍然不盡如人意[3]。目前，許多物理方法也通過維持微環境的穩定性來加速神經再生的速度和質量。超短波(ultrashort wave，USW)通過刺激神經血管的形成和神經滋養來改善血液循環、抑制炎癥狀態、減輕腫脹、為軸突生長和施萬細胞增殖提供氧氣和營養，以及增強組織代謝和神經系統功能[4]。本研究評估低劑量 USW對SCI的治療效果，以及轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、缺氧誘導因子1-α(hypoxia inducible factors 1-α,HIF-1α)和Nogo-NgR通路相關基因及蛋白表達的影響，為臨床治療SCI提供理論依據。

材料與方法

1.實驗動物：雄性SD大鼠30只，體質量200～220g，購自遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養環境：12h晝夜交替、溫度22～25℃、濕度45%～50%，環境清潔，通風良好，自由攝食、飲水。本研究通過沈陽醫學院實驗動物倫理學委員會審批[倫理審批號：研倫審第(2020)47號]，實驗期間各項操作符合《實驗動物管理條例》。

2.試劑與儀器：TGF-β1抗體(sc-130348)購自美國Santa Cruz公司；HIF-1α抗體(sc-13515)購自美國Santa Cruz公司；Nogo-A抗體(13401S)購自美國Cell Signaling Technology公司；NgR抗體(ab172653)購自英國Abcam公司；GAPDH抗體(AF0003)、鼠單克隆抗體(AG019)購自中國Beyutime公司；蛋白提取試劑盒、總RNA提取試劑盒(DP419)購自中國TIANGEN公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒(DRR420A)購自大連TAKARA公司；USW裝置[使用頻率40.68MHz，最大輸出功率40W，電流強度60mA左右(DL-CII，編號BB1404069)]購自汕頭市醫療器械廠。

3.大鼠SCI模型建立及USW干預：30只大鼠隨機分成對照組、模型組和USW組，每組10只。1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯臥固定，備皮消毒，確定T10棘突位置，分離皮下組織和兩側肌肉，暴露T9～T11棘突。用咬骨鉗分離T10棘突，暴露脊髓T9～T11平面(面積約4mm×6mm)，對照組僅進行椎板咬除，脊髓無損傷，模型組和USW組采用改良的Allen撞擊裝置，5g 打擊棒從5cm高度自由落體下落并對脊髓進行撞擊。模型組不做任何治療；USW組在損傷24h后，將大鼠置于固定器中，將一對直徑為 4cm 的圓盤電極放置在大鼠脊髓傷口的兩側，距離皮膚2cm，每天接受7min的USW治療，直至第4周末處死。末次USW治療后，麻醉處死，獲取2cm受損脊髓組織，一部分組織經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，置于-80℃保存。

4.行為學評分：在實驗造模后的1周、2周、3周、4周，所有大鼠的神經運動功能由兩名未參與本研究的技術人員使用運動評分量表(Basso-Beattie-Bresnahan，BBB)進行檢查，觀察時間為3分鐘/只。BBB 評分量表的范圍為0～21分，根據四肢運動的協調性、爪子的放置和尾部平衡等參數來判斷。其中0分表示沒有可觀察到的后肢功能，21分表示正常步態和功能齊全的后肢。同時進行斜板試驗：將大鼠身體軸線和斜板縱軸垂直后逐漸增大斜板坡度，當大鼠剛好能夠在斜板上停留5s，記錄此時坡度作為其肢體功能評分。

5.實時定量PCR檢測：取各組大鼠冰凍脊髓組織，并根據試劑盒說明書提取總RNA。使用5×First Strand cDNA Synthesis Master Mix試劑盒合成第一鏈cDNA。最后應用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行實時定量PCR。擴增條件如下：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 60s，40個循環，72℃ 4min。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參，2-ΔΔCt法對基因表達進行定量分析。所用PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，具體序列詳見表1。

表1 實時定量PCR的寡核苷酸引物列表

6.Western blot 法檢測：切碎脊髓組織，添加RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白含量后采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離的等量蛋白質，轉移到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的Tris 緩沖鹽水中的封閉，分別加入稀釋后的一抗(TGF-β1、HIF-1α、Nogo-A、NgR、GAPDH)4℃孵育過夜，洗膜后添加稀釋后的二抗于室溫下孵育1h，洗膜后采用電化學發光顯影，并在凝膠成像儀獲取圖像。

結 果

1.小劑量USW治療對大鼠BBB評分影響：對照組大鼠各時間點的BBB評分均在20分以上，表示基本無后肢運動障礙。與對照組比較，模型組各時間點的BBB評分降低(P<0.05)；與模型組比較，USW組各時間點的BBB評分升高(P<0.05)，但低于對照組(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠BBB評分比較分)

2.小劑量USW治療對大鼠斜板評分影響：對照組大鼠各時間點的斜板評分均在65分以上。與對照組比較，模型組大鼠各時間點的斜板評分降低(P<0.05)；與模型組比較，各時間點USW組大鼠斜板評分升高(P<0.05)，但低于對照組(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠斜板評分比較分)

3.小劑量USW治療對大鼠TGF-β1、HIF-1α的影響：對照組TGF-β1和HIF-1α mRNA低水平表達。與對照組比較，模型組TGF-β1和HIF-1α mRNA表達較對照組升高(P<0.05)；USW組TGF-β1和HIF-1α mRNA較模型組降低(P<0.05)，但高于對照組(P<0.05)。TGF-β1和HIF-1α蛋白表達與mRNA結果一致，詳見圖1。

圖1 各組TGF-β1和HIF-1α蛋白表達A.TGF-β1、HIF-1α蛋白表達水平；B.TGF-β1mRNA相對表達量；C.HIF-1α mRNA相對表達量。與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4.小劑量USW治療對大鼠Nogo-NgR通路的影響：對照組Nogo-A和NgR mRNA低水平表達。模型組Nogo-A和NgR mRNA表達較對照組升高(P<0.05)；USW組Nogo-A和NgR mRNA較模型組降低(P<0.05)，但高于對照組(P<0.05)。Nogo-A和NgR蛋白表達與mRNA結果一致，詳見圖2。

圖2 各組Nogo-A和NgR蛋白表達A.Nogo-A、NgR蛋白表達水平；B.Nogo-A mRNA相對表達量；C.NgR mRNA相對表達量。與對照組比較, *P<0.05;與模型組比較, #P<0.05

討 論

SCI是一種常見的臨床疾病，常導致四肢癱瘓[5]。脊髓損傷后通常伴隨著自發性和可塑性的軸突再生，有助于改善感覺和運動功能，但軸突再生是有限的[6]。脊髓損傷后的自然恢復需要持續數年，且恢復的效果不佳[7]。因此，開發可以加速恢復運動功能的新方法對于脊髓受損患者來說是重中之重。

超短波是一種高頻電磁波，具有穿透性強、作用部位深的特點，產生明顯的溫熱效應，目前作為一種治療方法，廣泛用于物理治療、康復醫學以及神經再生[8]。多項證據表明，超短波在脊髓損傷后修復發揮積極的促進作用。高琳等[9]研究表明，超短波可以調控大鼠脊髓損傷后巨噬細胞極化，繼而抑制炎性反應并促進脊髓損傷。Yin等[10]研究發現，骨髓間充質干細胞移植聯合USW輻射在促進 SCI 后功能恢復方面比單獨治療更有效，這可能是由于同時抑制炎癥和脊髓水腫，進而并促進神經功能恢復。筆者既往研究發現，USW通過抑制MK2促進 SCI 恢復和減輕 SCI 后的炎性反應[11]。BBB評分以及斜板評分是用來評價SCI大鼠后肢功能恢復程度的指標[12,13]。本研究中，超短波治療后能夠明顯提高脊髓損傷后大鼠的BBB評分以及斜板評分，表明USW療法對脊髓損傷有效。

脊髓損傷會在原始損傷部位和外部引發復雜的炎性反應，并加重組織損傷[14]。生長轉化因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)廣泛參與體內各種病理生理過程，與炎癥、創傷等多種疾病的發生、發展關系密切。研究表明，急性脊髓損傷后TGF-β1表達增加，可能與其具有免疫抑制、炎癥抑制的作用相關，是身體對神經損傷的自我保護反應[15]。Lei[16]研究發現，楊梅苷能夠部分通過TGF-β信號通路下調COX-2、TGF-β1、p53，從而發揮抗氧化和抗炎作用，促進SCI 大鼠的功能恢復。HIF-1α是一種轉錄因子，參與血管生成、細胞凋亡的生物學過程。研究報道，SCI 后的急性和慢性反應期，HIF-1α及其靶基因如血管生成分子的表達增加，在28天達到峰值，且HIF-1α mRNA及蛋白的表達情況與損傷情況和預后密切相關[17]。本實驗中在脊髓損傷后的24h給予低劑量USW治療，能夠有效降低大鼠脊髓組織中HIF-1α和TGF-β1 mRNA及蛋白的表達，表明低劑量USW治療能夠有效改善改善血液循環、抑制炎癥狀態。

Nogo-A是在中樞神經系統髓鞘中發現的Nogo家族的一員，已被確定為限制軸突再生的關鍵分子。脊髓損傷后，少突膠質細胞和髓鞘將細胞內Nogo-A釋放到細胞外基質中，并抑制軸突再生。研究表明，在體內應用的Nogo-A抗體不僅可以中和Nogo-A在少突膠質細胞和髓磷脂中表達的抑制功能，而且可以直接積極地增強神經元的再生[18]。NgR是Nogo-A的受體，在脊髓損傷后再生抑制信號轉導中起重要作用，而NgR的表達與中樞神經細胞再生能力直接相關，因此NgR被認為是其中之一促進軸突再生的重要靶點。研究報道，內源性NgR拮抗劑的缺失導致SCI后功能恢復的顯著延遲，而過表達內源性NgR拮抗劑顯著促進視神經和脊髓損傷后的軸突再生[19]。此外，Nogo-A與NgR結合后，將信息傳遞給神經細胞，生成NgR/p75NTR/LINGO-1復合物，進一步介導軸突生長抑制[20]。因此，Nogo/NgR信號通路在SCI后中樞神經系統中神經元和軸突的再生中發揮關鍵作用。本研究檢測了Nogo-A與NgR基因和蛋白的表達情況，結果顯示，低劑量USW治療顯著降低損傷脊髓組織Nogo-A與NgR基因和蛋白的表達，表明USW可能通過負性調控Nogo-NgR通路對脊髓損傷起到修復作用。

綜上所述，低劑量USW能夠通過下調脊髓Nogo/NgR的信號通路中Nogo-A與NgR mRNA及蛋白的表達，減輕局部缺氧環境，降低炎性反應，進而加快脊髓損傷后神經功能恢復，為臨床應用提供了較好的理論依據。