基于分子印跡聚合物的多菌靈電化學傳感器研究

程 鑫，王 鑫，吳宇森，張 雨，李瑩瑩，廉文靜

（天津農學院 基礎科學學院，天津 300384）

多菌靈作為一種廣譜性殺菌農藥，被普遍用作谷類作物和蔬菜水果等植物的殺菌劑。然而，多菌靈在食品中的殘留威脅人類健康，導致人體肝腎功能受損、出現惡心嘔吐等不良反應[1]。因此，國內外研究者探索構建了多種多菌靈分析檢測方法。目前，測定多菌靈殘留的方法主要有氣相色譜-質譜聯用法、紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附測定法等[2]。然而，這些常規方法存在儀器檢測過程煩瑣、樣品前處理過程復雜、對設備和人員的要求較高等缺點[3]。因此，亟待找到快速、靈敏、簡單的方法來檢測多菌靈農藥殘留量。

本研究將具有特異識別性、預定性的分子印跡技術與電化學方法相結合，建立多菌靈分子印跡電化學傳感器，選擇簡單、可控的電化學聚合方法，在玻碳電極（Glassy Carbon Electrode，GCE）表面合成多菌靈分子印跡聚合物（Molecular Imprinted Polymer，MIP），以鐵氰化鉀為探針，利用循環伏安法對影響多菌靈測定的各個實驗條件進行優化，得到最佳實驗參數。在優化后的實驗條件下，通過測定多菌靈標準溶液繪制標準曲線，得到分析性能參數，并將構建的多菌靈電化學傳感器應用于實際樣品中多菌靈的測定，為多菌靈的檢測和分析提供了快捷、靈敏、準確的方法。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

儀器：電化學工作站（CHI 660E型）；電子天平（BSA223S型）；三電極系統（以GCE電極為工作電極，分別以鉑絲電極和飽和甘汞電極為對電極和參比電極）；超聲波清洗儀（KH5200B型）。

試劑：多菌靈、吡咯、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉等，均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 GCE電極預處理

分別用粒徑為1.0 μm、0.3 μm、50 nm的氧化鋁粉拋光GCE電極，用蒸餾水沖洗電極后，分別在乙醇、蒸餾水中超聲洗滌20 s，最后用蒸餾水沖洗后晾干。

1.3 電聚合多菌靈MIP

以預處理后的GCE電極為工作電極構建三電極系統，置于含有15 mmol/L吡咯和5 mmol/L多菌靈、pH為6.8的0.1 mol/L磷酸緩沖液中進行循環伏安掃描，掃描電位為0～1.4 V，掃速為0.05 V/s，電聚合5圈，室溫晾干后得到多菌靈MIP/GCE電極。

1.4 洗脫與重結合

1.4.1 洗脫

將電聚合后的多菌靈MIP/GCE電極置于10 mmol/L NaOH溶液中，磁力攪拌15 min洗脫多菌靈，用蒸餾水沖洗后室溫晾干，得到洗脫后的MIP/GCE電極。該電極對多菌靈具有特異識別作用。

1.4.2 重結合

將洗脫后的MIP/GCE電極浸入不同濃度的多菌靈溶液中15 min，室溫干燥得到重結合后的MIP/GCE電極。

1.5 測試與表征

傳感器構建條件優化及性能研究均采用循環伏安法，以5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液（含0.1 mol/L KCl）為探針，掃描電位為﹣0.2～0.6 V，掃描速度為0.10 V/s。

2 結果與討論

2.1 吡咯與多菌靈比例優化

參照以吡咯為功能單體電聚合制備MIP的文獻報道常用參數[4]，以GCE電極為工作電極構建三電極系統，分別置于含有5 mmol/L多菌靈和5、10、15、20 mmol/L吡咯以及pH為6.8的0.1 mol/L磷酸緩沖液中進行循環伏安掃描，在0～1.4 V以0.05 V/s掃描，電聚合5圈后，在GCE電極表面得到多菌靈MIP膜，即MIP/GCE電極，用10 mmol/L NaOH溶液洗脫MIP/GCE電極15 min后，以洗脫后的MIP/GCE電極為工作電極構建三電極體系，在5 mmol/L鐵氰化鉀探針溶液中進行循環伏安測定，記錄鐵氰化鉀的氧化峰電流值。如圖1所示，吡咯與多菌靈濃度比值為3，即多菌靈濃度為5 mmol/L、吡咯濃度為15 mmol/L時，得到的吡咯特異性識別位點最多。

圖1 吡咯與多菌靈比例優化

2.2 電聚合圈數優化

以含有5 mmol/L多菌靈和15 mmol/L吡咯、pH為5.2的0.1 mol/L磷酸緩沖液為電聚合溶液，電聚合方法和參數同2.1，分別在GCE電極表面電聚合3、4、5、6圈，得到多菌靈MIP膜，并研究鐵氰化鉀探針溶液在洗脫后的MIP/GCE電極表面的電化學響應。如圖2所示，當電聚合圈數為5圈時，鐵氰化鉀的氧化峰電流最大，多菌靈的特異性識別位點數量最多。

圖2 電聚合圈數優化

2.3 洗脫及重結合時間優化

以常用的NaOH溶液作為洗脫劑，將電聚合后的多菌靈MIP/GCE電極置于10 mmol/L NaOH溶液中，分別磁力攪拌洗脫5～20 min，用蒸餾水沖洗后室溫晾干，得到洗脫不同時間后的MIP/GCE電極。測定鐵氰化鉀探針溶液在洗脫不同時間后的MIP/GCE電極表面的電化學響應，結果如圖3A所示，15 min為最佳洗脫時間。

圖3 洗脫（A）和重結合（B）時間優化

將洗脫后的多菌靈MIP/GCE電極置于4×10-5mol/L多菌靈溶液中，分別孵化5～25 min。在探針溶液中測得如圖3B所示的循環伏安曲線。由測定結果可知：當重結合時間為5～15 min時，隨著時間的延長，氧化峰電流逐漸降低，這是因為電極表面的部分分子印跡膜特異性識別結合位點被多菌靈重新占據，阻礙了探針的電子傳遞；當重結合時間為20～25 min時，氧化峰電流與重結合15 min基本相同。因此，15 min為最佳重結合時間。

2.4 傳感器構建過程表征

利用循環伏安法測定鐵氰化鉀探針在傳感器構建過程中不同電極上的電化學響應，以研究傳感器對多菌靈的識別作用。如圖4所示，多菌靈MIP/GCE電極（曲線b）的氧化峰電流值明顯小于GCE電極（曲線a），這是因為電聚合后的電極表面被致密的MIP膜占據，影響了鐵氰化鉀在電極表面的氧化還原反應。重結合4×10-5mol/L多菌靈后電極（曲線d）的氧化峰電流值小于洗脫后的MIP/GCE電極（曲線c），因為洗脫后電極呈現多孔結構，有利于鐵氰化鉀探針分子穿過、到達電極表面發生氧化還原反應。重結合時，電極表面的立體空穴又會再次被多菌靈分子占據。基于以上分析，本研究所構建的分子印跡電化學傳感器對多菌靈具有識別作用。

圖4 鐵氰化鉀探針在GCE電極（a）、MIP/GCE電極（b）、洗脫后的MIP/GCE電極（c）、重結合多菌靈后電極（d）上的循環伏安曲線

2.5 標準曲線的繪制

用建好的傳感器測定1×10-3～1×10-9mol/L多菌靈溶液，先測定洗脫后多菌靈MIP/GCE電極在鐵氰化鉀探針溶液中的循環伏安氧化峰電流值I0，再將洗脫后的電極在不同濃度多菌靈溶液中孵化15 min，測得氧化峰電流值Ipa。記錄多菌靈標準溶液濃度c與ΔIpa(I0－Ipa)的關系，繪制如圖5所示的標準曲線，得到傳感器的線性方程：ΔIpa（μA）=1.621 7（μA）+0.154 9c（μmol/L），線性范圍為3×10-8～7×10-5mol/L，最低檢出限為2.13×10-8mol/L（S/N=3）。

圖5 傳感器的標準曲線

3 結語

將分子印跡技術與電化學檢測方法結合，構建多菌靈分子印跡電化學傳感器，采用電化學聚合法，以多菌靈為模板分子、吡咯為功能單體，在電極表面合成多菌靈MIP。通過對傳感器構建過程實驗條件的優化，在最佳實驗條件下，將構建的多菌靈分子印跡傳感器應用于不同濃度多菌靈溶液的測定。該多菌靈分子印跡電化學傳感器具有穩定性強、特異識別性強及測定高效等優點，具有較大的實際應用潛力。