銀杏葉雙黃酮的提取及純化研究

戴煒辰，涂清波

（南京中醫(yī)藥大學翰林學院，江蘇 泰州 225300）

銀杏葉是銀杏科植物銀杏（Ginkgo bilobaL.）的干燥葉，性平，味甘、苦、澀，歸心肺經，具有斂肺平喘、活血化瘀、通絡止痛之功效。銀杏葉的主要成分為黃酮類和萜內酯類[1]，而銀杏葉黃酮類化合物根據化學結構可分為單黃酮、雙黃酮和兒茶素等。其中，雙黃酮含量較高[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，銀杏葉雙黃酮具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗微生物、抗癌、神經保護和心血管保護等作用[3]。目前，關于銀杏葉黃酮提取分離與純化工藝的研究較多[4]，但是對銀杏葉雙黃酮提取和純化工藝的研究很少。因此，本研究探索了表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取銀杏葉總黃酮的工藝，在此基礎上研究了雙黃酮的提取和純化工藝，為銀杏葉雙黃酮的應用奠定基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（TD10002型，天津天馬衡基儀器有限公司）；超聲清洗機（KQ-500B，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計（UV-1100型，上海美譜達儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-S1，金壇市醫(yī)療儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵[SHZ-D（Ⅲ），上海錦賦實驗儀器設備有限公司]；高速離心機（H1850，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Agilent 1220 Infinity LC（安捷倫科技有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁標準品、銀杏葉雙黃酮標準品（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；纖維素酶（上海藍季生物）；醋酸鹽緩沖溶液（pH=3.5）；吐溫20、吐溫80、司盤80（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等均為分析純。

2 銀杏葉總黃酮的提取

2.1 標準曲線的繪制和總黃酮得率的計算

以蘆丁為標樣，測定銀杏葉總黃酮含量。配制質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，精確吸取標準溶液0、2、4、6、8、10、12、14、16 mL置于50 mL容量瓶中。分別加入5%亞硝酸鈉溶液2 mL，混勻，靜置6 min后，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻，靜置6 min。分別再加入4%氫氧化鈉溶液20 mL，以水定容至刻度，搖勻，放置15 min后，以未吸取蘆丁標準品的溶液為空白，在510 nm波長處測定其吸光度[5]。以蘆丁質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線并求回歸方程：

式中：ρ為根據標準曲線計算得到的樣品黃酮質量濃度，mg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；N為樣品的稀釋倍數；m為銀杏葉粉末質量，mg。

2.2 提取方法

銀杏葉中黃酮的提取一般采用超聲法[5]或酶解法[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在超聲輔助酶解法的基礎上加入表面活性劑，3項技術聯(lián)用可以極大地提高總黃酮得率。將新鮮銀杏葉低溫烘干，用粉碎機粉碎后過60目篩，分別采用以下方法提取，結果如圖1所示。

（1）超聲提取：稱取2.0 g銀杏葉粉末，加入120 mL 70%乙醇溶液，40 ℃超聲提取40 min。過濾后，取一定量的濾液，定容，紫外測定吸光度并計算得率。

（2）酶解提取：稱取2.0 g銀杏葉粉末，置于50 mL容量瓶中，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液及15 mg纖維素酶，45 ℃酶解2 h，滅酶，用70%乙醇定容，提取后過濾。取一定量濾液，定容，紫外測定吸光度并計算得率。

（3）表面活性劑提取：稱取2.0 g銀杏葉粉末，加入20 mL蒸餾水，50 ℃浸提10 min后，加入0.4 g吐溫80繼續(xù)浸提20 min。過濾，取一定量提取液，定容，紫外測定吸光度并計算得率。

（4）表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取：稱取2.0 g銀杏葉粉末，加入10 mg纖維素酶、20 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取，10 min后加入0.4 g表面活性劑（分別為吐溫20、吐溫80和司盤80），繼續(xù)超聲20 min。過濾，取一定量提取液，定容，紫外測定吸光度并計算得率。

由圖1可知，相對于超聲提取和酶解提取，采用表面活性劑的銀杏葉總黃酮得率明顯提高，而表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取效果更好。分別選取3種常用的表面活性劑（吐溫20、吐溫80、司盤80），聯(lián)用超聲酶解法提取后發(fā)現(xiàn)，吐溫20作為表面活性劑的提取效果最佳。因此，選取吐溫20聯(lián)用超聲酶解法作為銀杏葉黃酮的提取方法。

圖1 不同提取法對銀杏葉總黃酮得率的影響

2.3 銀杏葉總黃酮的提取工藝

銀杏葉黃酮提取采用表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法，分別考察表面活性劑用量、纖維素酶用量、料液比和提取時間對總黃酮得率的影響，確定提取工藝條件。

2.3.1 表面活性劑用量的確定

稱取2.0 g銀杏葉粉末5份，各加入10 mg纖維素酶、20 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取10 min后分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g吐溫20，繼續(xù)超聲20 min，過濾，取一定量提取液，定容，紫外測定吸光度并計算得率，結果如圖2所示。由圖2可知，當吐溫20的用量達到0.6 g，即質量濃度為0.03 g/mL時，總黃酮得率最高；當吐溫20的質量濃度繼續(xù)增大時，得率下降。

圖2 表面活性劑用量對總黃酮得率的影響

2.3.2 纖維素酶用量的確定

稱取2.0 g銀杏葉粉末5份，分別加入2、6、10、14、18 mg纖維素酶，加入20 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20，繼續(xù)超聲20 min，過濾，取一定量提取液，定容，紫外測定吸光度并計算得率，結果如圖3所示。由圖3可知，當纖維素酶的質量濃度為0.5 mg/mL時，總黃酮得率最高；當纖維素酶的質量濃度繼續(xù)增大時，得率明顯下降。

圖3 纖維素酶用量對總黃酮得率的影響

2.3.3 料液比的確定

稱取2.0 g銀杏葉粉末6份，各加入10 mg纖維素酶，分別加入20、40、60、80、100、120 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20，繼續(xù)超聲20 min，過濾，取一定量提取液，定容，紫外測定吸光度并計算得率，結果如圖4所示。由圖4可知，當料液比在1∶40～1∶50時，總黃酮得率較高。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響

2.3.4 提取時間的確定

稱取2.0 g銀杏葉粉末6份，各加入10 mg纖維素酶、100 mL蒸餾水，50 ℃超聲提取10 min后加入0.6 g吐溫20，分別超聲至總提取時間為30、40、50、60、70、80 min，過濾，取一定量提取液，定容，紫外測定吸光度并計算得率，結果如圖5所示。由圖5可知，當提取時間為60～70 min時，總黃酮得率較高；當提取時間繼續(xù)延長時，得率明顯下降。

圖5 提取時間對總黃酮得率的影響

2.4 銀杏葉總黃酮的提取條件

根據以上實驗可以得到優(yōu)化的提取條件：表面活性劑選用吐溫20，用量為0.03 g/mL；纖維素酶用量為0.5 mg/mL；料液比為1∶50；提取時間為70 min。最后確定的工藝總黃酮得率達到1.207%。采用表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取，不僅提高了銀杏葉總黃酮得率，也為雙黃酮的進一步純化奠定了基礎。

3 銀杏葉雙黃酮的純化

銀杏葉雙黃酮的純化一般采用傳統(tǒng)的硅膠柱層析色譜法[7]，然而，大量雜質或其他成分的干擾會使銀杏葉提取物經柱層析后損失較多的雙黃酮。考慮到黃酮可以與硫酸鋅等絡合[8]，與部分雜質分離，本研究嘗試采用金屬絡合法預處理銀杏葉提取液，發(fā)揮部分純化的作用，再進行柱層析分離。通過比較雙黃酮的提取率與純度，對上述純化方法進行評價。

3.1 銀杏葉雙黃酮純化方法

3.1.1 直接硅膠柱層析法

取50 mL銀杏葉提取液，用50 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，減壓干燥后以少量乙酸乙酯溶解，濕法上樣，以石油醚-乙酸乙酯（100∶1→1∶1）梯度洗脫，洗脫量為5～8倍柱體積。將收集的洗脫液減壓濃縮，得銀杏葉雙黃酮樣品。

3.1.2 金屬絡合聯(lián)合硅膠柱層析法

取100 mL銀杏葉提取液，加入0.5 g硫酸鋅，充分攪拌至反應完全后，邊攪拌邊滴加NaOH溶液，調節(jié)pH至9。離心，收集沉淀，加入50 mL 50%乙醇，加入0.2 g乙二胺四乙酸鈉，于60 ℃水浴中振蕩反應至沉淀完全溶解。減壓干燥，再加25 mL甲醇溶解，過濾，濾液減壓干燥，得到粗品。

精制：粗品以少量乙酸乙酯溶解，按照上述硅膠柱層析法得到銀杏葉雙黃酮樣品。

3.2 銀杏葉雙黃酮成分的測定

采用高效液相色譜法測定上述樣品中雙黃酮的得率與純度。

（1）色譜條件：Kromasil C18色譜柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-乙酸（85.0∶15.0∶0.8）；流速：1.0 mL/h；檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

（2）標準曲線的繪制：分別取2、4、8、12、16 mg銀杏葉雙黃酮標準品，放入50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，充分溶解后進行液相檢測。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程。

（3）樣品的準備：將銀杏葉提取液經微孔濾膜過濾后進樣；上述兩種純化工藝所得樣品分別以甲醇溶解，經微孔濾膜過濾后進樣。

3.3 結果與討論

按前述色譜條件進行檢測，結果如圖6所示。由圖6可知，雙黃酮的出峰時間在4.5 min，根據峰面積以及標準曲線的回歸方程計算出雙黃酮的純度及得率。由表1可知，采用金屬絡合聯(lián)合硅膠柱層析法所得樣品中，銀杏葉雙黃酮的得率和純度分別為0.18%和72.00%，相比直接柱層析法，損失較少，雙黃酮的純度也進一步提高。

圖6 不同純化工藝下的液相色譜圖

表1 純化工藝及提取液中雙黃酮的得率和純度比較

4 結語

優(yōu)化了表面活性劑聯(lián)用超聲酶解法提取銀杏葉總黃酮，表面活性劑選用0.03 g/mL吐溫20，纖維素酶用量為0.5 mg/mL，料液比為1∶50，提取時間為70 min，總黃酮的得率達到1.207%。在此基礎上，采用金屬絡合聯(lián)合硅膠柱層析法純化得到銀杏葉雙黃酮，純度得到大幅提升，得率也有所提升。此方法成本低、速度快，可為銀杏葉雙黃酮的開發(fā)利用奠定基礎。