UPLC-MS/MS法測定牛奶中氯霉素殘留量的不確定度評定

李紹群，嚴(yán)國榮，李 方，周雨薇，劉東方

（1.興化市食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心，江蘇 興化 225700；2.新沂市瓦窯中學(xué)，江蘇 徐州 221438）

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）的分子式為C11H12CL2N2O5，是氯霉素類抗生素的代表藥物，主要通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成起到抗菌的作用，抗菌譜比較廣，包括G+和G-，對傷寒桿菌、百日咳桿菌等均具有較強(qiáng)作用[1]。過量使用CAP會產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，臨床應(yīng)用因此受到限制[2]。

測量不確定度（Measurement Uncertainty，MU）簡稱不確定度，表示與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征被測量的量值分散程度[3]。一般情況下，不確定度越低說明檢測水平越高，檢測結(jié)果越可靠[4]。

樣品經(jīng)提取、凈化、內(nèi)標(biāo)法定量，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）處理，其準(zhǔn)確性易受到樣品處理、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、曲線擬合和儀器設(shè)備穩(wěn)定性的影響，測量數(shù)據(jù)難免產(chǎn)生誤差。本研究根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)并參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，對測定牛奶中CAP質(zhì)量分?jǐn)?shù)方法的不確定度進(jìn)行評定。

1 試驗(yàn)

1.1 材料與試劑

甲醇中的CAP（壇墨，100 μg/mL，1.2 mL）；乙腈D5-CAP（內(nèi)標(biāo)，壇墨，100 μg/mL，1.2 mL）；乙腈、甲醇（均為色譜純）；氨水、乙酸乙酯（均為分析純）；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水；親水親脂平衡（Hydrophile Lipophilic Balance，HLB）固相萃取柱（安譜，60.00 mg，3.0 mL）；含CAP的牛奶質(zhì)控樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-MS/MS（TQS/I-Class，Waters）；渦旋儀（DL-866，IKA）；電子分析天平（FA3204B，萬分之一）；臺式高速冷凍離心機(jī)（3K15，SIGMA）；氮吹儀（TTL-DCI）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q）；移液器（100～1 000 μL、20～200 μL和2～20 μL，Eppendorf）；不同規(guī)格量瓶。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取與凈化

準(zhǔn)確稱取樣品（2.00±0.02）g于50.0 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)D5-CAP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50 μL，準(zhǔn)確加入10.0 mL 95%氨化乙酸乙酯（乙酸乙酯與氨水的體積比為95∶5），振蕩5 min，10 000 r/min離心3 min，量取上清液5.0 mL，40 ℃氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?.5 mL甲醇復(fù)溶，振蕩1 min，2.0 mL水稀釋混勻，待凈化。

取HLB固相萃取柱（60.00 mg，3.0 mL），依據(jù)說明書進(jìn)行凈化。量取0.5 mL 50%乙腈水溶液復(fù)溶，渦旋1 min，過濾待分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

100.0 μg/L D5-CAP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精確量取100 μg/mL D5-CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，10倍梯度逐級稀釋至目標(biāo)質(zhì)量濃度，有效期3個(gè)月。

50.0 μg/L CAP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精確量取100 μg/mL CAP溶液1.0 mL，逐級稀釋至目標(biāo)質(zhì)量濃度，有效期1個(gè)月。

1.3.3 系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確量取適量CAP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和50 μL D5-CAP內(nèi)標(biāo)工作溶液，分別加入6份經(jīng)提取、凈化的空白樣品中，40 ℃氮?dú)獯蹈桑_量取適量50%乙腈水溶液復(fù)溶，配制成CAP質(zhì)量濃度依次為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L，含D5-CAP內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為5.0 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾待分析。

1.3.4 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜和質(zhì)譜條件參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行優(yōu)化。數(shù)據(jù)采集和處理軟件為MassLynx 4.0。

1.4 數(shù)據(jù)采集及模型建立

以得到的目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值y與相應(yīng)的CAP質(zhì)量濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過最小二乘法擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax+b，a為斜率，b為截距。

樣品中CAP質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式：

式中：X為樣品中CAP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；ρ為樣品溶液中CAP的質(zhì)量濃度，μg/L；m為供試品稱樣質(zhì)量，g；f為樣品溶液稀釋因子。

1.5 不確定度來源分析

利用UPLC-MS/MS法測定牛奶中CAP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，根據(jù)檢測過程分析可知，測定不確定度的來源主要有樣品的稱量、提取與凈化、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、標(biāo)準(zhǔn)品純度、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、加標(biāo)回收和重復(fù)精密度等因素。

2 不確定度結(jié)果與分析

2.1 樣品稱量引入的不確定度urel(m)

試樣稱量用電子天平感量為0.01 mg，由計(jì)量證書可知，天平的示值誤差為±0.05 mg，稱量不確定度服從均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

樣品稱量質(zhì)量W為2 024.00 mg，則樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2 樣品前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)

2.2.1 樣品前處理過程中量器引入的不確定度urel(V1)

吸量管引入的不確定度由吸量管校準(zhǔn)與溫度效應(yīng)引入的不確定度組成。前處理用吸量管均為A級，其量程V為10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 mL，查閱JJG 196—2006《中華人民共和國計(jì)量檢定規(guī)程 常用玻璃量器》[6]可知，A級吸量管在20 ℃下的容量允差如。按照三角形分布考慮，

10.0 mL量器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

其他規(guī)格吸量管依上述過程進(jìn)行計(jì)算。

2.2.2 樣品前處理溫度引入的不確定度urel(T1)

樣品前處理過程中所用玻璃量器在20 ℃下校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室溫度一般在（20±5）℃，由于玻璃量器受溫度影響較小，忽略不計(jì)。本實(shí)驗(yàn)前處理用試劑有乙腈、乙酸乙酯、甲醇和水，溶劑體積膨脹系數(shù)a分別為1.37×10-3/℃、1.39×10-3/℃、1.18×10-3/℃、2.08×10-4/℃，則50%乙腈水溶液的體積膨脹系數(shù)為7.89×10-4/℃。

在配制樣品溶液時(shí)，實(shí)驗(yàn)室溫度為22 ℃，溫度變化按矩形分布時(shí)，以量取10.0 mL乙酸乙酯為例，溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(T10)：

溫度引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(T10)：

2.2.3 樣品前處理引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

依據(jù)2.2.1和2.2.2計(jì)算過程，在樣品溶液配制過程中，環(huán)境溫度和體積引入的不確定度分別為urel(V1)=0.005 94，urel(T1)=0.003 11。

樣品溶液制備過程中產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(std)

由標(biāo)準(zhǔn)品證書可知，CAP標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度綜合考慮了原料純度定值結(jié)果、制備過程、量值核驗(yàn)、均勻性、穩(wěn)定性等引入的不確定度分量。100 μg/mL甲醇中CAP溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對誤差為3%（k=2）。

其相對不確定度為：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋移液器引入的不確定度urel(V2)

移液器引入的不確定度由移液器校準(zhǔn)與溫度效應(yīng)引入的不確定度組成。系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制所用Eppendorf移液器規(guī)格為100～1 000 μL（允差±1.0%）、20～200 μL（允差±2.0%）、2～20 μL（允差±8.0%）、10.000 mL量瓶（允差±0.020 mL），查移液器檢定規(guī)程[7]，測量不確定度的分析方法同2.2.1章節(jié)，不同移液體積不確定度結(jié)果分別為urel(V1000)=0.004 1、urel(V100)=0.006 1、urel(V10)=0.016 3、urel(V10量瓶)=0.000 8，使用頻次分別為12、2、2、6次。由量器體積允差引入的累積相對不確定度urel(V2)=[0.004 12×12+0.006 12×2+0.016 32×2+0.000 82×6]1/2=0.028 5。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過程溫度引入的不確定度urel(T2)

在配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，移液槍頭材質(zhì)為聚乙烯，膨脹系數(shù)較小，受溫度影響忽略不計(jì)[7]。當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，分析方法同2.2.2，urel(T2)為0.001 6。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

在系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρ)：

2.4 儀器校準(zhǔn)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

urel(E)通常用B類不確定度評定，根據(jù)儀器說明書和校準(zhǔn)證書，質(zhì)譜和液相的最大允許誤差均為1.0%[8]，按均勻分布，則：

2.5 標(biāo)準(zhǔn)線性回歸擬合引入的不確定度urel(q)

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中平均峰面積比值分別為0.081 6、0.114 0、0.169 3、0.414 2、1.036 1、2.430 3，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測定3次，測得峰面積比值以及擬合曲線y=0.490 2x－0.011 4，相關(guān)系數(shù)R=0.996 3。

測得峰面積的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差：

在質(zhì)控樣品的檢測過程中，重復(fù)測量樣品30次（p=30）；校準(zhǔn)曲線中CAP測定的總次數(shù)n=18；校準(zhǔn)曲線中6個(gè)質(zhì)量濃度的理論平均值ρ1=1.466 7 μg/L；測得質(zhì)控樣品峰面積比平均值為1.738 3，質(zhì)控樣品溶液中CAP質(zhì)量分?jǐn)?shù)X測為0.858 8 μg/kg；

由此校準(zhǔn)曲線擬合引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

式中：ρ0為樣品中CAP的質(zhì)量濃度，μg/L；ρ1為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液質(zhì)量濃度的平均值，μg/L；b為擬合工作曲線的斜率；ρi為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，μg/L；n=18為系列標(biāo)準(zhǔn)曲線總進(jìn)樣次數(shù)。

2.6 測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(D)

平行測定6次加標(biāo)樣品，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)X為0.441 μg/kg、標(biāo)準(zhǔn)偏差S(X)為0.005 7，計(jì)算得到重復(fù)測定引入的不確定度u(D)=S(X)/2.449=0.002 3和相對不確定度urel(D)=u(D)/X=0.005 3。

2.7 回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

加標(biāo)6個(gè)樣品，回收率分別為85.4%、87.6%、90.2%、86.2%、89.6%、90.6%，平均回收率R為88.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S(R)=0.021 9，計(jì)算得到回收率引入的不確定度u(R)=S(R)/2.449=0.008 9和相對不確定度urel(R)=u(R)/R=0.010 1。

用t檢驗(yàn)法考察回收率R與1之間是否具有顯著差異：

t大于雙側(cè)臨界值t（95，5）=2.571，則回收率R與1之間具有顯著差異，需要回收率R校正測定結(jié)果，則牛奶樣品中CAP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為X：

2.8 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展

合成不確定度等于各分量方差之和的正平方根，即合成相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度公式：

代入上述結(jié)果：urel(X)=[0.001 152+0.006 712+0.028 52+0.008 22+0.018 72+0.005 32+0.010 12]1/2=0.037 5。

通過計(jì)算，質(zhì)控樣中CAP的合成標(biāo)準(zhǔn)測定不確定度：

當(dāng)包含因子k=2時(shí)，置信概率P為95%[9]，則質(zhì)控樣的擴(kuò)展不確定度：

質(zhì)控樣品牛奶中CAP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.004 μg/kg，根據(jù)評定結(jié)果，牛奶中CAP質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果X=（1.004±0.075）μg/kg，k=2。

3 討論

本研究通過評定發(fā)現(xiàn)，樣品前處理、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、添加回收率、設(shè)備校準(zhǔn)、樣品稱量和重復(fù)測定的不確定度分量對整體不確定度貢獻(xiàn)較大。

在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的過程中，適當(dāng)增大液體量取體積、使用更加精確的量取工具，可以進(jìn)一步降低引入的不確定度；增加標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測量次數(shù)、優(yōu)化儀器自身數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和增加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣量，可以降低由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度[9-10]。通過以上試驗(yàn)操作，可降低各分量產(chǎn)生的不確定度，進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為牛奶中CAP的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。