面包樹樹葉類黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化性評價*

袁鳳娟，于 璐，張 萌，王 巖

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

面包樹(Artocarpusaltilis)是桑科(Moraceae)波羅蜜屬(Artocarpus)的常綠喬木，因其可食用的果實富含淀粉且具有面包狀質地而得名[1-3]。面包樹在中國主要分布在海南和臺灣等地[3,4]。面包樹的葉、根、莖和皮常被用作熱帶地區(qū)的傳統藥物，能夠緩解哮喘、高血壓、腹瀉等疾病[5,6]，同時也可用作衣服材料、建筑材料和動物飼料[7,8]。面包樹樹葉富含類黃酮、三萜類等二次代謝產物，其中以異戊二烯類黃酮含量最為豐富[9,10]。許多異戊二烯類黃酮化合物對多種細胞系(如小鼠白血病P388、人體鼻咽癌KB、小鼠L-1210和結腸38等細胞)有較強的細胞毒活性，對花生四烯酸5-脂氧合酶具有抑制作用以及對致齲細菌具有抗菌活性[11]。活性研究結果表明，面包樹中的類黃酮單體具有抗氧化、抗炎、抗血小板凝集和抑制組織蛋白酶K等生物活性[12-14]。

類黃酮的提取方法主要包括熱水提取法、堿性水溶液提取法、醇提法、超聲波輔助提取法、微波提取法、酶解法、回流提取法和大孔樹脂吸附法等[15-17]。其中熱水提取法僅限于提取黃酮苷類物質，但提取雜質較多，回收率較低。堿性水溶液提取法提取出的類黃酮大多具有酚羥基，呈酸性，易在堿性水溶液或醇溶液浸出，同樣存在雜質浸出的問題。醇提法是目前主要的提取方法，一般認為醇濃度增高有利于總類黃酮提取，常見的有冷浸法、滲漉法和回流法。超聲波輔助提取法也是目前主流的提取方法，利用超聲波的空化作用破壞細胞膜，促進類黃酮釋放。此外，根據不同原理，常用的提取手段還包括微波提取法、酶解法和大孔樹脂吸附法等。由于各種方法都有各自的優(yōu)缺點，考慮到提取物的性質、提取成本、工藝設備及類黃酮的提取率等因素，本試驗擬采用常溫提取法、回流提取法、超聲波輔助提取法提取面包樹樹葉中的總黃酮，通過比較3種不同的提取方法，以類黃酮得率和含量為考察結果，得到最佳的類黃酮提取工藝，同時對提取后的類黃酮成分進行抗氧化活性評價，以期為面包樹樹葉類黃酮化合物的分離純化和生物活性評價奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面包樹樹葉在2019年采集于海南省保亭黎族苗族自治縣保城鎮(zhèn)，將采集到的樹葉在陰暗條件下自然風干，粉碎機粉碎，晾干貯藏。無水乙醇、冰醋酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉均購于天津市凱通化學試劑有限公司，2,2-二苯基-1-間三硝苯基聯肼(DPPH)、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)均購于上海麥克林生化科技有限公司，其余試劑均購于天津市凱通化學試劑有限公司且均為分析純。

1.2 儀器設備

DL-360E型超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)，BSA124S型電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]，752型紫外可見光分光光度儀(上海光譜儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線制定及類黃酮含量和得率的測定

參照Meda等[18]的方法繪制蘆丁標準曲線。稱取配置的0.2 mg/mL蘆丁標準溶液，分別取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL離心管中，加入0.3 mL 5% NaNO2搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10% AlCl3，靜置6 min。然后加入4.0 mL 10% NaOH，用蒸餾水定容至10 mL，靜置15 min，于510 nm處測定反應液的吸光度，以吸光值為縱坐標，標準溶液中蘆丁的質量濃度為橫坐標作標準曲線，根據曲線方程y=1.2457x+0.0171,R2=0.999 8，計算樣品中的類黃酮含量。取3組平行實驗結果計算類黃酮得率，類黃酮得率的計算公式如下：類黃酮得率(%)=類黃酮濃度C(mg/mL)×提取液總體積V(mL)/樣品質量M(g)×103×100%。

1.3.2 不同提取方式對類黃酮得率和含量的影響

準確稱取面包樹樹葉粉末10 g，放入500 mL燒杯中，在固液比1∶8 (g/mL)、乙醇溶液體積分數80%、提取時間2 h的條件下進行提取，分別采用以下3種方式：常溫提取法、回流提取法(70℃)、超聲波輔助提取法(70℃)。將3種提取方式所得的溶液分別在4 000 r/min的轉速下離心30 min，旋轉蒸發(fā)，倒出上清液，水浴加熱蒸干后，放入恒溫干燥箱得到干燥物，每個處理方式重復3次。按照1.3.1節(jié)的方法計算出類黃酮的得率和含量。

1.3.3 單因素試驗

準確稱取干燥的面包樹樹葉粉末5 g，放入100 mL燒杯中，選取提取時間(20 min、40 min、60 min、80 min、100 min)、固液比[1∶4 (g/mL)、1∶6 (g/mL)、1∶8 (g/mL)、1∶10 (g/mL)、1∶12 (g/mL)]、乙醇體積分數(60%、70%、80%、90%、100%)、提取溫度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)、提取次數(1次、2次、3次、4次、5次) 5個因素進行單因素試驗，按照1.3.2節(jié)得到的最佳提取方式進行提取，將所得溶液在4 000 r/min的轉速下離心30 min，旋轉蒸發(fā)，倒出上清液，水浴加熱蒸干后放入恒溫干燥箱中得到干燥物，平行3次試驗。按照1.3.1節(jié)的方法計算出類黃酮的得率和含量。

1.3.4 響應面優(yōu)化

按照Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，采用Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗，在單因素試驗的基礎上，以提取時間(X1)、乙醇體積分數(X2)、固液比(X3)、提取溫度(X4)為自變量。根據前期試驗，確定提取時間40-100 min、乙醇體積分數70%-100%、固液比1∶6-1∶12 (g/mL)、提取溫度60-90℃為取值區(qū)間，并以編碼值+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平。面包樹樹葉類黃酮得率為YA，試驗自變量因素編碼及水平見表1。

表1 響應面試驗自變量因素編碼與水平

1.3.5 DPPH自由基清除率測定

參照Thaipong等[19]的測定方法，首先取2 mL不同濃度的樣品溶液與2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混勻，在黑暗條件下反應30 min，于517 nm測量吸光度(Ai)；其次將2 mL 不同濃度的樣品溶液與2 mL無水乙醇混勻，在黑暗條件下反應30 min，于517 nm測量吸光度(Aj)；最后將2 mL 0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液與2 mL無水乙醇做對照，在黑暗條件下反應30 min，于517 nm測量吸光度(A0)。DPPH自由基清除率(K)的計算公式如下：K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

1.3.6 ABTS+自由基清除率測定

參照Re等[20]的測定方法，首先將7 mmol/L ABTS溶液與13.24 mg過硫酸鉀混合16 h，生成ABTS+自由基溶液；其次將所得溶液冷藏后稀釋，在734 nm處測量吸光度(Xi)；然后將1.0 mL不同濃度的樣品溶液與1.9 mL ABTS+自由基溶液混合，放置7 min后，于734 nm處測量吸光度(Xj)；最后將1.0 mL不同濃度的樣品溶液與1.9 mL 無水乙醇溶液混合，放置7 min后于734 nm處測量吸光度(X0)。ABTS+自由基清除率(R)的計算公式如下：R=[1-(Xi-Xj)/X0]×100%。

1.4 數據處理

采用Design-Exper 8.0.6、Statistix 8軟件分析試驗數據，采用Graphpad Prism 7軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 提取方式對面包樹樹葉類黃酮得率和含量的影響

使用不同的提取方式測定面包樹樹葉中的類黃酮得率和含量的結果如圖1所示。常溫提取下的類黃酮得率為3.23%，類黃酮含量為0.318 5 mg/mL。超聲波輔助提取下的類黃酮得率為4.77%，含量為0.686 8 mg/mL，回流提取方式下的類黃酮得率為4.21%，含量為0.510 8 mg/mL。通過比較可以看出，超聲波輔助提取法在類黃酮得率及含量兩個指標上均高于其他兩種方式，因此采用超聲波輔助提取法進行下一步試驗。

Different letters indicate significant differences (P<0.05)

2.2 提取時間對面包樹樹葉類黃酮得率和含量的影響

隨著提取時間的增加，類黃酮得率逐步上升，60 min后處于緩慢的上升趨勢(圖2)。當提取時間為100 min時，類黃酮的得率達到最大值。隨著時間的增加，類黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，80 min時類黃酮含量最高，而后下降可能是由于隨著提取時間的增加，類黃酮含量已趨于飽和狀態(tài)，類黃酮結構改變使其含量下降。

Different letters indicate significant differences (P<0.05)

2.3 固液比對面包樹樹葉類黃酮得率和含量的影響

由圖3可知，在固液比為1∶4 (g/mL)時類黃酮得率較低，因為此時溶劑過少，已達到飽和狀態(tài)，還有大量溶質未溶解。隨著固液比增加，得率呈先上升后逐漸下降的趨勢，當固液比達到1∶10 (g/mL)時類黃酮得率最高。在固液比為1∶4-1∶6 (g/mL)時，隨著溶劑增加，類黃酮含量明顯增多；在固液比為1∶6-1∶8 (g/mL)時類黃酮含量趨于穩(wěn)定；在固液比為1∶8-1∶12 (g/mL)時，類黃酮含量呈明顯下降趨勢，固液比為1∶8 (g/mL)時類黃酮含量最高。

Different letters indicate significant differences (P<0.05)

2.4 乙醇體積分數對面包樹樹葉類黃酮得率和含量的影響

隨著乙醇體積分數的增大，類黃酮得率和含量均呈先上升后下降的趨勢，在乙醇體積分數為90%時，類黃酮得率和含量最高(圖4)。分析原因可能是由于乙醇體積分數越大，與溶質碰撞的概率就越大，使類黃酮得率和含量達到最高，而后乙醇體積分數超過了類黃酮的最佳提取條件，導致提取效果下降。

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2.5 提取溫度對面包樹樹葉類黃酮得率和含量的影響

隨著提取溫度的升高，類黃酮得率呈先上升后下降的趨勢(圖5)。提取溫度在60-80℃時處于穩(wěn)定狀態(tài)，在80℃時類黃酮得率最大，而超過80℃時明顯下降，可能是因為溫度超過了乙醇的沸點，提取劑容易揮發(fā)，導致提取能力降低，從而影響類黃酮得率。隨著提取溫度的升高，類黃酮含量顯著上升，當溫度為70℃時，類黃酮含量最高，而高于80℃類黃酮含量明顯下降。

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2.6 提取次數對面包樹樹葉類黃酮得率和含量的影響

隨著提取次數的增加，類黃酮得率逐漸增大，但是在第2次提取后，類黃酮得率雖然上升，但是增速明顯變緩，直到第5次提取時類黃酮得率達到最高(圖6)。類黃酮含量隨著提取次數的增加呈先上升后緩慢下降的趨勢，分析原因可能是由于第2次提取時部分類黃酮沒有從溶劑中完全提取出來，使之后的類黃酮含量緩慢上升。

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2.7 響應面分析法優(yōu)化

從單因素試驗結果可以得出，在面包樹樹葉類黃酮提取過程中，類黃酮得率與含量呈相同的變化趨勢，因此單因素試驗以得率(YA)為指標對整個工藝進行優(yōu)化，Box-Benhnken試驗設計結果如表2所示。

回歸模型顯著性檢驗見表3。對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到類黃酮得率的二次多元回歸方程(模型)YA=0.084+3.260X1-3.191X2+2.527X3-7.284X4-6.556X1X3-2.482X1X4+3.611X2X3-2.681X2X4-4.408X3X4-0.019X12-0.018X22-0.022X32-0.017X42。對方程進行F檢驗可得出，失擬檢驗F失擬=5.63F0.01(14，4)=2.39，檢驗極顯著，能夠較好地反映面包樹樹葉類黃酮得率與4個影響因素之間的關系，同時復相關系數R2=0.952 6，說明采用此模型分析面包樹樹葉類黃酮的得率是可行的。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 回歸模型顯著性分析

回歸方程系數顯著性檢驗如表4所示，X4、X12、X22、X32、X42項對面包樹樹葉類黃酮得率的影響極顯著(P<0.01)，X1、X2、X1X2、X1X3、X3X4項對面包樹樹葉中類黃酮得率的影響顯著(P<0.05)，其他因素對實驗結果影響不顯著。根據回歸方程系數顯著性檢驗可以得出影響類黃酮提取程度的因素大小為提取溫度(X4)>提取時間(X1)>乙醇體積分數(X2)>固液比(X3)。

表4 回歸方程系數顯著性檢驗

2.8 交互作用因素分析

響應曲面分析與優(yōu)化模型中各因素交互作用對響應值YA的影響如圖7所示。曲面越彎曲說明該因素對類黃酮得率的影響越顯著。從圖7(a)可以看出，提取時間對類黃酮得率的影響最大，而乙醇體積分數影響最小。當乙醇體積分數不變時，隨著時間的增加，類黃酮得率亦增加，說明面包樹樹葉中的類黃酮逐漸溶解在乙醇中，當溶劑達到飽和狀態(tài)時，提取得率逐漸下降。從圖7(b)可以看出，當溫度不變時，隨著提取時間的增大，面包樹樹葉中的類黃酮得率亦增加；當提取時間到達一定值時，類黃酮得率反而呈下降趨勢。當提取時間一定時，溫度越高，得率越大。從圖7(c)可以看出，曲面彎曲程度最小，說明固液比和提取溫度的交互作用對類黃酮得率影響最小。

圖7 乙醇體積分數、提取時間、提取溫度和固液比對類黃酮得率影響的等高面和響應曲面分析

2.9 響應面方程驗證

響應面軟件得出的最佳提取工藝為乙醇體積分數86.15%、固液比1∶8.3 (g/mL)、提取溫度74.03℃、提取時間71.33 min，類黃酮得率為8.56%。以此條件進行驗證試驗，類黃酮得率為8.87%，理論與實際得率誤差為0.31%，此時類黃酮含量為0.93 mg/mL。

2.10 DPPH自由基清除能力

隨著質量濃度的增大，類黃酮提取物和抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力逐漸增強(圖8)。當質量濃度達到0.6 mg/mL時，類黃酮提取物和抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力最大，分別為89.62%和97.89%。類黃酮提取物對DPPH自由基的IC50值為0.23 mg/mL。

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2.11 ABTS+自由基清除能力

隨著質量濃度的升高，面包樹樹葉類黃酮提取物和抗壞血酸對ABTS+自由基表現出強烈的清除作用(圖9)。且當質量濃度為0.06 mg/mL時，清除率均達到最大，類黃酮提取物和抗壞血酸對ABTS+自由基的清除率分別為90.26%和97.87%。類黃酮提取物對ABTS+自由基的IC50值為0.024 mg/mL。

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3 討論

采用傳統工藝提取面包樹樹葉中的類黃酮成本較高，類黃酮得率和純度也較低，而采用超聲波輔助提取法不僅可以縮短提取時間，還能提高提取效率，且有效成分也易于分離純化。孔方等[21]采用綠色新型低共熔溶劑結合超聲波輔助提取法提取廢棄蘋果葉中總黃酮的效果最好，得率為7.06%。劉小娟等[22]采用超聲波輔助提取衢枳殼總黃酮，得率為6.21%。本研究以常溫提取法、回流提取法和超聲波輔助提取法3種方法提取面包樹樹葉類黃酮化合物，發(fā)現超聲波輔助提取法在類黃酮得率及含量兩個指標上均高于其他兩種方式，分析其原因可能是超聲波提高了分子的熱運動頻率，使分子間的碰撞次數增多，進而使溶質更易溶于溶劑中。本研究使用超聲波輔助提取法和響應面分析法優(yōu)化得到面包樹樹葉類黃酮的最佳提取工藝，類黃酮得率為8.87%，表明超聲波輔助提取法能顯著提高面包樹樹葉類黃酮的提取量，試驗優(yōu)化得到的技術參數穩(wěn)定可靠。

提取條件對提取工藝效果有較大的影響，各提取方法原理不盡相同。根據本試驗得出的最佳提取工藝條件進行以下分析：隨著提取時間的延長，類黃酮物質與溶劑的接觸越充分，得率逐漸升高，但到達一定時間后，由于細胞內外類黃酮溶質的濃度差達到平衡，得率逐漸趨于穩(wěn)定；隨著固液比的增大，溶質更易于擴散至膠束溶液中，膠束溶液用量越大，類黃酮得率越高；提取溫度的升高有利于分子熱運動速率的提升，有利于類黃酮分子在乙醇中溶解，但溫度過高，會加劇乙醇的揮發(fā)，同時易破壞類黃酮的部分結構；乙醇是公認的提取類黃酮的綠色溶劑，根據“相似相溶”的原理，乙醇濃度在80%左右時與類黃酮苷元的極性相似[23,24]。

類黃酮化合物廣泛存在于各種植物中，是一類具有發(fā)展前景的天然植物抗氧化劑。唐靜月等[25]研究鐵皮石斛花總黃酮對DPPH自由基、ABTS+自由基的清除能力發(fā)現，總黃酮含量與抗氧化活性具有相關性。趙旭萍等[26]研究發(fā)現，多羽鳳尾蕨中總黃酮提取物具有較強的DPPH自由基清除能力。本研究結果表明，當提取物質量濃度為0.6 mg/mL時，面包樹樹葉類黃酮對DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率分別為89.62%、90.26%，表明面包樹樹葉類黃酮具有良好的抗氧化性，可為后續(xù)相關抗氧化劑的研究提供參考依據。但是面包樹樹葉類黃酮的具體化學成分種類及含量仍需進一步研究，以期為抗氧化劑的研究奠定理論基礎。

4 結論

本研究通過比較3種提取方式得出超聲波輔助提取法為面包樹樹葉類黃酮的最佳提取方法，在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法對提取工藝進行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為乙醇體積分數86.15%、固液比1∶8.3 (g/mL)、提取溫度74.03℃、超聲時間71.33 min，各個因素對面包樹樹葉類黃酮提取的影響順序為提取溫度>提取時間>乙醇體積分數>固液比。抗氧化試驗結果顯示，面包樹樹葉類黃酮對DPPH和ABTS+自由基具有較高的清除性能，且當質量濃度達到最大時，可得到與抗壞血酸相當的抗氧化效果。綜上可知，面包樹樹葉類黃酮含量與其抗氧化性存在極大的相關性，具有廣闊的發(fā)展利用空間。