環頸雉骨蛋白風味蛋白酶水解工藝條件的優化

翟學超 王帥

摘要：? 選用風味蛋白酶對環頸雉骨蛋白進行水解，在風味蛋白酶的最適溫度50 ℃和pH值7.0條件下，以水解度（DH）和氮回收率為指標，優化出風味蛋白酶最適的水解條件：底物濃度為2 g/100 mL，[E]/[S]為2∶100，水解時間4 h。研究表明：在此條件下骨蛋白水解液的水解度和氮收率較為合理，為后續的美拉德反應產生風味物質提供豐富的反應原料，打下良好的基礎。

關鍵詞：? 風味蛋白酶;? 骨蛋白;? 水解

中圖分類號：? ?S 865? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001 - 9499（2022）01 - 0047 - 03

畜禽骨是一種營養極為豐富的天然資源，其約占胴體的10%～15%，骨本身含有11%～14%的蛋白質，我國是蛋白質資源相對較少的一個國家，因此，高效利用與綜合開發骨蛋白質資源具有一定的實際意義[ 1 ]。肉類天然風味物質的生產與制備作為食用香精的一個新興產業，近年來發展尤為迅速，并由此形成了一個由酶水解、美拉德反應、超臨界萃取及噴霧干燥等多種處理方法于一體的天然風味物質生產體系[ 2 - 4 ]。酶解工程技術和美拉德反應是生產天然肉類風味物質的主要方法。酶解能較為高效的利用骨中的蛋白，令其水解成多肽和氨基酸，水解產物更易被人體消化吸收[ 5 ]，還可進一步與糖進行美拉德反應，在最大限度保存了風味物質天然性和營養物質完整性的同時，生產出具有較高風味特征的風味物質。改善了傳統香精的耐高溫性差、香味駐留時間短、存儲條件苛刻、風味不自然等缺點。

本試驗通過摸索水解骨湯中骨蛋白時的水解條件，包括底物濃度、酶與底物濃度比、水解時間等，以水解度和氮收率作為標準，篩選最佳的反應條件。

1 試驗材料

1. 1 材料與主要試劑

環頸雉骨、風味蛋白酶（Flavourzyme 2×104 U/g）（北京索萊寶科技有限公司）、十二烷基磺酸鈉（SDS）（美國Sigma試劑公司）、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）（上海天虹生物有限公司）、TEMED（北京百奧萊博）、過硫酸銨（APS）（美國Sigma試劑公司）、牛血清白蛋白（BSA）（美國Sigma試劑公司）、甘氨酸（上海藍源試劑公司）、丙烯酰胺（Acr）（美國Sigma試劑公司）、β-巰基乙醇（美國Amersco試劑公司）、SDS蛋白Marker（美國NEB公司）。

1. 2 儀器與設備

高速離心機TGL-16C、ORP3.0型pH計、JA1003? N-5003N電子天平、精密電子天平AB 204-N、L9 Plus 雙光束紫外可見分光光度計、電熱恒溫水浴鍋HH-? ? ? ? M4、精密增力電動攪拌器JJ-1。

2 研究方法

2. 1 珍禽骨蛋白水解液的制備及條件優化

取500 mL骨湯置于燒瓶中，采用蒸餾水稀釋和部分濃縮的方法，依次將骨湯的底物濃度調節至2%、3%、4%、5%、6%、7%。用已配制好的1 mol/L的NaOH溶液調節骨湯體系的pH值，使其接近風味蛋白酶的最適pH值（7.0），向其中加入1∶100（[E]/[S]）的風味蛋白酶，并于該酶最適酶解溫度（50℃）條件下恒溫振蕩水解4 h[ 6 ]，在水解反應進行的過程中，根據反應進程向體系內加入1 mol/L的NaOH溶液，使體系pH維持在相對穩定狀態，記錄耗堿量，并以此通過公示計算水解度。水解完成后沸水浴10 min，以消除殘余酶的活性，得珍禽骨蛋白水解液。測定水解物的水解度和氮收率，篩選出最佳的底物濃度，并于該底物濃度條件下，以同樣方法在0.5∶100，1∶100，1.5∶100，2∶100，2.5∶100的[E]/[S]中篩選出最佳的[E]/[S]。

2. 2 水解度的測定

水解度計算公式[ 7 ]為：

DH（%） =×100

h=B×Nb×1/α×1/MP

式中：h-單位質量蛋白質中被水解的肽鍵的量（mmol/g）;htot-單位質量蛋白質中肽鍵的總量（mmol/g），血蛋白htot-8.8mmol/g;B-水解過程中所消耗的堿量（mL）;Nb -堿液的濃度（mol/L）;MP -水解液中蛋白質的品質（g）;1/α-校正系數（堿性蛋白酶1/α=1.105，中性蛋白酶1/α=1.400）。

2. 3 氮收率的測定

氮收率計算公式為[ 8 ]：

氮收率×100%

式中水解液中和骨湯中蛋白含量均按照國標GB5009.5-2010方法進行的測定，采用凱氏定氮法測定水解液和骨湯中的蛋白含量。

2. 4 硫酸銨標準曲線的繪制

分別準確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL濃度為100 mg/L的硫酸銨標準溶液于10 mL帶塞比色管中，再分別向其中加入4 mL乙酸銨緩沖液和4 mL顯色劑，加水補足至刻度，蓋緊玻璃塞，震搖1 min，開塞，放入沸水浴中反應15 min，此后取出并將其浸沒于冷水中快速降溫至室溫，于400 nm的波長下測得吸光值。以硫酸銨含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

2. 5 統計分析

試驗重復2次，至少一式三份分析。所有數據均采用平均值±S.D，采用數據軟件SPSS16.0進行顯著性以及相關性分析。顯著性水平為P<0. 05。

3 結果與分析

3. 1 不同底物質量濃度對水解度和氮收率的影響

由不同底物濃度對水解度和氮收率的影響（圖1）可知：使用風味蛋白酶對骨湯中的蛋白進行水解，隨著底物濃度的升高，體系的水解度和氮收率呈降低的趨勢。當底物濃度為2 g/100mL時，水解度和氮收率都為最高;隨著底物濃度升高，水解度和氮收率逐漸減少，這主要是由于底物濃度較低時，底物與底物之間的空間較大，在同等加酶量的條件下，底物的相對含量較少，風味蛋白酶處于主導地位，可與環頸雉骨蛋白進行充分的接觸，因此此時的水解度和氮收率處于較高的水平;底物濃度過大則會阻礙酶和底物的充分接觸，此時底物處于主導地位，導致水解度和氮收率下降。

3. 2 不同酶與底物濃度比對水解度和氮收率的影響

由不同酶與底物濃度比對水解度和氮收率的影響（圖2）可知：在風味蛋白酶的[E]/[S]由0.5∶100遞增至2.5∶100的過程中，水解度和氮收率均出現了增加的趨勢。其中水解度的上升趨勢較為均衡，當[E]/[S]為2.5∶100時，水解度達到最大。[E]/[S]在0.5∶100～2∶100的范圍內時，隨著[E]/[S]的繼續增大，氮收率的上升速度趨向平緩，在[E]/[S]由2∶100向2.5∶100增加過程中，氮回收率出現拐點。氮收率的上升速度則呈現出前期穩定增加后期逐漸減小的趨勢，因此選擇[E]/[S]為2∶100作為環頸雉骨蛋白水解的最適加酶量。

3. 3 不同水解時間對美拉德反應中間產物及氨基酸態氮損失率的影響

由不同水解時間對美拉德反應中間產物（A294 nm）和氨基酸態氮損失率的影響（圖3）可知：A294 nm在0.5～6 h的水解時間內，總體呈上升趨勢。氨基酸態氮損失率在0.5～4 h內的上升速度相對較快，而在4～5 h內逐漸趨于平緩，最終維持在8%左右，幾乎不再出現變化。這是因為一定量骨湯中的蛋白被風味蛋白酶水解的時間不同，水解液中的蛋白、短肽、氨基酸等的含量也不盡相同，但骨湯中的蛋白含量是一定的，隨著水解時間的延長，水解程度也越發徹底。隨著后續美拉德反應的進行，水解液中有限的蛋白、短肽、氨基酸等逐漸被耗盡，反應原料不足，最終導致氨基酸態氮損失率維持在一定極限水平不再變化。綜上所述，選取水解時間為0.5～4 h的水解液作為美拉德反應的基液相對較好。

3. 4 不同水解時間水解液中蛋白質及短肽的SDS-PAGE電泳變化

由不同水解時間水解液的SDS-PAGE電泳（圖4）可知：未風味蛋白酶水解的原骨湯蛋白大分子肽段顯色條帶顏色深度明顯。但隨著水解時間的延長，骨湯蛋白大分子肽段的顯色條帶逐漸變淺、顯色帶深度逐漸下移，說明骨湯蛋白分子正逐漸被酶水解。在水解1 h的時候，在代表分子量為27.0 kDa～212 kDa的蛋白質大分子條帶消失的同時，會在6.5 kDa～20.0 kDa之間生成新的條帶，顯色帶深度下移，說明隨著水解時間的延長，小分子量肽段的數量在增加，平均分子量逐漸減小;但隨著水解時間的延長，水解程度進一步提高，體系內的大分子物質進一步減少。當水解時間達到4 h時，泳道內已無明顯條帶，這意味著風味蛋白酶將珍禽骨蛋白完全水解。

4 結 論

通過使用風味蛋白酶，在酶的最適溫度50 ℃和最適pH值7.0條件下，于一定時間內采用不同的底物濃度和[E]/[S]對骨湯進行水解，以水解度和氮收率為參考，并根據實際情況優化選擇出最適的水解條件：底物濃度為2 g/100 mL，[E]/[S]為2∶100，水解時間4 h。研究表明：在此條件下環頸雉骨蛋白水解液的水解度和氮收率較為合理，為后續的美拉德反應產生風味物質提供豐富的反應原料，打下良好的基礎。

參考文獻

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第1作者簡介：? 翟學超（1981-），? 男，? 副研究員，? 碩士研究生，? 主要從事特種經濟動物及野生動物標準化研究。

通訊作者：? 王帥（1981-），? 男，? 副研究員，? 碩士，? 主要從事特種經濟動物保育和標準化工作。

收稿日期： 2021 - 01 -? 20

（責任編輯：? ?李 丹）