高濃度膽紅素對(duì)流式細(xì)胞術(shù)外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的干擾和消除方法

薛 燕， 許 俐， 黨利亨， 王 朝， 崔亞瓊， 王 萍， 王 寧， 張新杰， 劉 洋

[1.天津市兒童醫(yī)院（天津大學(xué)兒童醫(yī)院） 天津市兒科研究所 天津市兒童出生缺陷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津市兒童醫(yī)院（天津大學(xué)兒童醫(yī)院）新生兒內(nèi)科，天津 300134]

目前，流式細(xì)胞術(shù)（ flow cytometry，F(xiàn)CM）已在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，其檢測(cè)結(jié)果受樣本采集、抗體選擇、紅細(xì)胞裂解方法等多種因素的影響[1-2]。在實(shí)際工作中，我們發(fā)現(xiàn)部分高濃度膽紅素樣本存在異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的CD3+細(xì)胞群與CD3-細(xì)胞群熒光表達(dá)分界不清，進(jìn)而影響設(shè)門的情況，直接影響了FCM檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于膽紅素對(duì)具體檢測(cè)項(xiàng)目的干擾機(jī)制及其糾正方法的研究[3-4]，但目前尚無(wú)膽紅素對(duì)FCM檢測(cè)的干擾的報(bào)道，且試劑說(shuō)明書中亦無(wú)相關(guān)信息。為了驗(yàn)證高濃度膽紅素是否會(huì)對(duì)采用FCM檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生干擾，本研究擬采用配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)評(píng)估高濃度膽紅素對(duì)FCM外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年10月—2021年10月于天津市兒童醫(yī)院住院，血清總膽紅素（total bilirubin，TB）＞200 μmol/L，且進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的患兒51例，依據(jù)直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）或間接膽紅素（indirect bilirubin，IBil）水平分為高DBil組（DBil＞171 μmol/L 6例，其中男2例、女4例，年齡5個(gè)月～14歲，包括自身免疫性肝炎2例、急性肝功能衰竭2例、肝豆?fàn)詈俗冃?例、自身免疫性溶血性貧血 1例）和高IBil組[IBil＞171 μmol/L，45例，其中男25例、女20例，年齡1～41 d，包括新生兒高膽紅素血癥28例、新生兒溶血癥（ABO血型不合）7例、新生兒敗血癥10例]。另選取健康體檢兒童6名作為對(duì)照組，其中男3名、女3名，年齡1～11歲，采集其血液樣本（無(wú)黃疸）作為對(duì)照樣本。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采用 FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）及配套六色淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)662967）檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+）百分比、B細(xì)胞（CD3-CD19+）百分比、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞（CD3-CD16+/CD56+）百分比。首次檢測(cè)采用染色-裂解的免洗方法，具體操作步驟：在流式管中依次加入20 μL抗體、50 μL乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝全血樣本，震蕩混勻后在室溫下避光反應(yīng)15 min，然后加入450 μL FASC溶血素（美國(guó)BD公司）裂解紅細(xì)胞，震蕩混勻后在室溫下避光孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 TB和DBil檢測(cè) 采用cobas c701全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）或cobas c501全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（重氮法）檢測(cè)血清TB和DBil水平。計(jì)算IBil（IBil=TB-DBil）。TB、DBil和IBil的參考區(qū)間分別為0～26、0.0～8.0、3.4～10.3 μmol/L。

1.2.3 干擾試驗(yàn) 采用配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)分析膽紅素對(duì)FCM淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的干擾。將高DBil組樣本離心后制備成高DBil血漿，濃度分別為198.1、222.0、229.0、350.4、483.4、1 086.5 μmol/L，分別取50 μL加入隨機(jī)配對(duì)的對(duì)照樣本中，作為干擾樣本。2種樣本均按染色-裂解的免洗方法處理，并采用FCM檢測(cè)。

1.2.4 高濃度膽紅素干擾消除方法 （1）洗滌-染色-裂解法：將高DBil組樣本進(jìn)行洗滌-染色-裂解處理，吸取200 μL EDTA抗凝全血加入流式管中，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）震蕩混勻，350×g離心5 min，輕輕吸取2 mL上清，棄去。將剩余樣本染色、裂解，并采用FCM檢測(cè)。（2）染色-裂解-洗滌法：將干擾樣本進(jìn)行染色-裂解-洗滌處理，在經(jīng)染色-裂解免洗方法處理的干擾樣本中加入2 mL PBS，震蕩混勻，350×g離心5 min，輕輕吸取2 mL上清，棄去。剩余樣本采用FCM檢測(cè)。

1.2.5 干擾劑量評(píng)估 取4份無(wú)黃疸EDTA抗凝全血樣本，每份樣本按50 μL/管分裝，分別加入6個(gè)流式管中。取干擾檢查A試劑盒（日本Sysmex公司，批號(hào)ER8001）中的DBil干粉，加2 mL蒸餾水，溶解成3 236 μmol/L的高濃度原液，隨后用PBS稀釋成6個(gè)濃度梯度。分別吸取10 μL梯度溶液加入含50 μL全血樣本的流式管中，將每份樣本配制成6個(gè)DBil濃度梯度（0、100、150、200、250、500 μmol/L），覆蓋低、中、高濃度范圍。將所有樣本進(jìn)行染色、裂解處理，采用FCM檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估干擾樣本與對(duì)照樣本淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高DBil組和高IBil組膽紅素檢測(cè)結(jié)果

高DBil組TB為330（241.4～741.6）μmol/L，DBil為289.7（216.0～634.2）μmol/L。高IBil組TB為227.4（211.1～263.6）μmol/L，DBil為14.0（11.2～21.4）μmol/L。

2.2 高DBil組和高IBil組淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

高IBil組基于六色熒光表達(dá)的淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門策略不受影響，見(jiàn)圖1。高DBil組均出現(xiàn)FITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)分界不清，見(jiàn)圖2。

圖1 高IBil組淋巴細(xì)胞亞群分析散點(diǎn)圖

圖2 高DBil組經(jīng)染色-裂解法處理后FITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)情況

2.3 干擾試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照樣本FITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)分界清晰。采用染色-裂解法處理干擾樣本后，出現(xiàn)FITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)分界不清。見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照樣本和經(jīng)染色-裂解法處理后的干擾樣本FITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)情況

2.4 DBil干擾劑量

隨著DBil水平的升高，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3-與 CD3+細(xì)胞群逐漸靠近。當(dāng)DBil≤150 μmol/L時(shí)，干擾較小，對(duì)FCM設(shè)門基本無(wú)影響；當(dāng)DBil≥200 μmol/L時(shí)，干擾較大，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群出現(xiàn)部分重疊，影響FCM設(shè)門。見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度DBil樣本經(jīng)染色-裂解處理后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)情況

2.5 干擾消除方法

高DBil組樣本經(jīng)洗滌-染色-裂解法處理和干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌法處理后，采用FCM檢測(cè)，結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群的熒光表達(dá)分界清晰。見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 高DBil組樣本經(jīng)洗滌-染色-裂解法處理后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3-與 CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)情況

圖6 干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌法處理后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3-與 CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)情況

干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌法處理后的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照樣本經(jīng)染色-裂解方法處理后的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌方法處理與對(duì)照樣本經(jīng)染色-裂解方法處理的淋巴細(xì)胞亞群百分比比較

2.6 對(duì)照樣本與干擾樣本經(jīng)處理后淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌法處理后的CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+、CD3-CD16+/56+、CD3-CD19+細(xì)胞百分比和CD4/CD8比值與對(duì)照樣本均呈顯著正相關(guān)（r值分別為0.977、0.994、0.950、0.941、0.996、0.965，P＜0.05）。

3 討論

為了驗(yàn)證膽紅素成分是否能干擾FITC標(biāo)記的CD3抗原的熒光表達(dá)，本研究設(shè)立了高DBil組和高IBil組。同時(shí)，結(jié)合工作中遇到的存在這種問(wèn)題的樣本，本研究將樣本入選標(biāo)準(zhǔn)定為血清TB＞200 μmol/L。

田禾等[5]發(fā)現(xiàn)，高濃度膽紅素對(duì)FITC熒光信號(hào)的檢測(cè)有一定的干擾，且膽紅素濃度越高，干擾越大，但具體干擾機(jī)制尚不明確。膽紅素是人體血清中重要的內(nèi)源性熒光物質(zhì)之一，在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下，呈現(xiàn)熒光發(fā)射光譜，其發(fā)射光主峰在520 nm處[6-7]。標(biāo)記CD3抗原的FITC的最大激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm，發(fā)射光主峰在520 nm處。由于膽紅素和FITC的發(fā)射光譜非常接近，因此會(huì)發(fā)生熒光信號(hào)疊加，這可能是高濃度膽紅素會(huì)對(duì)FITC標(biāo)記的CD3抗原的熒光表達(dá)產(chǎn)生干擾的原因。

本研究結(jié)果顯示，與高IBil組相比，高DBil組更易出現(xiàn)CD3-與CD3+細(xì)胞群分界不清。配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將高濃度DBil血漿加入非黃疸樣本會(huì)導(dǎo)致FITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)分界不清，表明熒光信號(hào)受到了干擾。IBil與DBil對(duì)FITC熒光信號(hào)表現(xiàn)出不同的影響，可能與二者在人體內(nèi)的存在形式不同有關(guān)。IBil是紅細(xì)胞被破壞后形成的膽紅素，在外周循環(huán)中以與白蛋白結(jié)合的形式存在，不溶于水，每個(gè)白蛋白可以結(jié)合2個(gè)IBil分子。史曉敏等[8]的研究結(jié)果顯示，當(dāng)IBil水平很高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致白蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，形成一些比較微小的顆粒物質(zhì)。這種微小的顆粒可能在FCM淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的設(shè)門策略的第1步，即以SSC/CD45設(shè)門分析定位淋巴細(xì)胞時(shí)已經(jīng)被判斷為非淋巴細(xì)胞的顆粒，不納入后續(xù)設(shè)門，因此對(duì)FITC熒光信號(hào)無(wú)影響。DBil是經(jīng)過(guò)肝臟加工后的膽紅素，其實(shí)質(zhì)為膽紅素分子與1個(gè)或2個(gè)葡萄糖醛酸分子單獨(dú)酯化形成的結(jié)構(gòu)，易溶于血漿和樣本處理所用的裂解液，因此可能對(duì)FITC熒光信號(hào)的干擾較大。

本研究結(jié)果顯示，DBil對(duì)采用FCM檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群的干擾程度會(huì)隨濃度的升高而增大，當(dāng)血中DBil≤150 μmol/L時(shí)，干擾較小，對(duì)設(shè)門基本無(wú)影響，不會(huì)影響FCM檢測(cè)；當(dāng)血中DBil≥200 μmol/L時(shí)，干擾較大，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群出現(xiàn)部分重疊，影響設(shè)門。如不采取有效措施解決此問(wèn)題，將影響FCM檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究結(jié)果還顯示，采用洗滌-染色-裂解和染色-裂解-洗滌2種方法均能有效消除DBil對(duì)FITC熒光信號(hào)的干擾。從操作步驟上來(lái)說(shuō)，洗滌-染色-裂解方法是在發(fā)現(xiàn)干擾后重新處理樣本，而染色-裂解-洗滌方法是將采用免洗方法處理的樣本僅通過(guò)洗滌這1個(gè)步驟即可再次上機(jī)檢測(cè)。后者更節(jié)約時(shí)間，且經(jīng)染色-裂解-洗滌方法處理的干擾樣本淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照樣本比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），二者淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性良好（r值均＞0.94，P＜0.05）。

目前，淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)在臨床上已廣泛開(kāi)展。然而，高DBil樣本經(jīng)過(guò)洗滌后，無(wú)法通過(guò)單平臺(tái)直接得出各淋巴細(xì)胞亞群準(zhǔn)確的絕對(duì)計(jì)數(shù)。本研究結(jié)果顯示，此類樣本洗滌后各淋巴細(xì)胞亞群的百分比與未干擾樣本比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，可以根據(jù)洗滌前總淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和洗滌后重新檢測(cè)得到的各淋巴細(xì)胞亞群的百分比，通過(guò)計(jì)算獲得各淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)。若流式細(xì)胞儀專用軟件檢測(cè)結(jié)果中不包括總淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)，也可以通過(guò)公式：洗滌前總淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)=（洗滌前淋巴細(xì)胞群區(qū)域的事件數(shù)/洗滌前絕對(duì)計(jì)數(shù)微球區(qū)域的事件數(shù)）×[每次測(cè)定的微球數(shù)量/總體積（50 μL）]計(jì)算得出，式中每次測(cè)定的微球數(shù)量可在絕對(duì)計(jì)數(shù)管包裝標(biāo)簽上找到，試劑批次不同該值可能會(huì)不同。

綜上所述，高濃度DBil會(huì)干擾FITC的熒光信號(hào)，導(dǎo)致采用FCM檢測(cè)FITC標(biāo)記的CD3-與CD3+細(xì)胞群熒光表達(dá)分界不清。采用染色-裂解-洗滌方法處理，可最大程度地消除這種干擾，保證FCM檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。