以丙三醇為穩定劑的精漿檢測質控品性能評價

張 琛， 李 婷， 孟慶昊， 謝 楠， 張為民， 趙 飛， 李 敏， 高 選， 楊斯桀

（山東大學附屬生殖醫院醫學檢驗科，山東 濟南 250001）

精漿生化分析是用于評估男性生殖能力的重要的檢驗項目，涵蓋許多用于診斷男性不育和男性生殖系統疾病的生化標志物。精漿生化檢測結果的準確性對于臨床診療尤為重要。陸金春等[1]開展的精漿生化檢測項目外部質控調研結果顯示，男科學實驗室開展的精漿果糖、α-葡萄糖苷酶檢測結果差異很大，有必要標準化，男科實驗室應建立有效的質控措施[2]。精漿生化指標的全自動檢測均應帶有相應項目的商品化或自制質控品[3]。目前的精漿生化質控品大部分為原廠適配試劑，無法檢測試劑批次/盒間或患者樣本偏移趨勢，而精漿生化檢測項目又缺乏第三方的質控品，故實驗室自制精漿生化質控品是目前進行室內質控較好的選擇。自制質控品與商品化質控品比較，其優勢是不受運輸條件影響，且為人源性樣本，能夠最大程度減少基質效應，更真實、準確地反映檢測系統的穩定性。有研究發現，丙三醇是蛋白類項目質控品比較好的穩定劑[4]。本研究選用丙三醇作為穩定劑配制精漿生化質控品，并與未加入任何穩定劑的精漿原液進行對比，分別對2種質控品的均勻性、穩定性和實驗室日常質控結果進行評價，以期獲得穩定、低成本的質控品，規范精漿生化項目的檢測。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2019年11—12月山東大學附屬生殖醫院進行精液檢測的精液樣本。要求受檢者禁欲2～7 d，采用手淫法留取精液樣本，收集1次射精的全部精液于清潔、無毒、密閉的取精管內（深圳博銳德公司），置于37 ℃水浴箱中完全液化。納入標準：精液完全液化，pH值≥7.2，精子活動率≥50%，前向運動精子百分率≥40%；受檢者乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、人類免疫缺陷病毒篩查結果為陰性，無生殖道或泌尿系統感染。本研究通過山東大學附屬生殖醫院醫學倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 分離精漿 將符合要求的患者剩余精液樣本3 000×g離心15 min，取上層精漿，混合后制備成質控品，使用漩渦振蕩器將其充分混勻。

1.2.2 分組 根據實驗目的將混合精漿分為2份，其中1份加入占精漿體積30%的丙三醇溶液（A組），另1份不加入任何穩定劑（B組）。

1.2.3 分裝保存 將充分混勻后的精漿生化質控品一邊用一次性吸管吹打使其一直保持混勻狀態，一邊用移液器分裝于eppendorf管內，每管500 μL，每組各制作180管，置于-20 ℃冰箱凍存。

1.2.4 檢測 采用Chemwell BRED 2900型全自動精漿生化免疫分析儀（美國Awareness公司）檢測精漿果糖和精漿中性α-葡萄糖苷酶，試劑盒購自深圳博銳德公司。

1.3 精漿生化質控品的性能評價

根據CNAS-GL03《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》[5]的要求對精漿生化質控品的均勻性和穩定性進行性能評價。（1）均勻性評價。隨機抽取2種質控品各10管，于室溫下放置15 min后融化混勻，連續檢測每管質控品2次并記錄數據，并進行單因素方差分析，根據F值查表判斷質控品是否均一。（2）穩定性評價。分別于質控品配制后的第1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85天隨機抽取2種質控品各3支，置于液氮罐中保存。于第86天將定期抽取的質控品從液氮罐中取出，置于室溫下放置15 min后融化混勻，每管質控品連續檢測2次，并記錄數據。檢測方法：質控品配制后每7天從-20 ℃冰箱內取出6份樣本置于液氮罐內保存，至第85天時從液氮罐內全部取出進行檢測，每管質控品連續檢測2次并記錄數據，并進行t檢驗，根據t值查表判斷質控品是否穩定。（3）2種精漿生化質控品每日常規檢測。每天取出2種質控品各1支，隨當日臨床標本進行精漿果糖和精漿中性α-葡萄糖苷酶檢測，并記錄數據，連續檢測30 d，根據30個數據點計算、s和變異系數（coefficient of variation，CV）。（4）A組精漿生化質控品的長期日常質控檢測。根據前期實驗結果，選定A組作為實驗室長期使用的精漿生化質控品，連續檢測6個月，并記錄數據，根據所得數據點計算、s和CV。

1.4 統計學方法

1.4.1 均勻性 采用Excel軟件統計均勻性檢驗數據，并進行單因素方差分析，分別計算2個組的F值。在每次抽取10個樣本，每個樣本測定2次的條件下，F臨界值為F0.05（9，10）=3.02，若計算所得的F值＜3.02，表示質控品的均勻性較好。

1.4.2 穩定性 采用Excel軟件統計穩定性檢驗數據，并進行t檢驗，分別計算2個組的t值。在穩定性評價測定6次（每次3管，每管測定2次）的條件下，t臨界值為t0.05（5）=2.57，若計算所得的t值＜2.57，表示質控品的穩定性較好。

1.4.3 日常質控數據處理 采用SPSS 19.0軟件比較2個組的CV。正態分布數據采用±s表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 均勻性檢驗結果

2種精漿生化質控品精漿果糖和精漿中性α-葡萄糖苷酶的F值均＜3.02，均勻性較好。見表1。

表1 2個組精漿生化質控品均勻性檢測結果

2.2 穩定性檢驗

將2種精漿生化質控品第8、15、22、29、36、43、57、64、71、78、85天的質控數據分別與第1天的質控數據進行t檢驗，結果顯示，A組第8、15、22、29天的精漿果糖質控數據所得t值均＜2.57（臨界值），提示29 d內A組質控品的精漿果糖項目穩定；B組質控品的精漿果糖數據從第8天開始計算，所得t值＞2.57，提示B組質控品的精漿果糖項目在8 d內無法保持穩定。A組的精漿中性α-葡萄糖苷酶結果在實驗期間所得t值均＜2.57，提示A組質控品的精漿中性α-葡萄糖苷酶項目在85 d內均穩定；B組質控品在第8、15、22、29天的精漿中性α-葡萄糖苷酶質控數據所得t值均＜2.57，提示29 d內B組質控品的精漿中性α-葡萄糖苷酶項目穩定。見表2。

表2 2個組2種精漿生化質控品穩定性評價結果（t值）

2.3 每日常規質控檢測結果

對2種精漿生化質控品分別連續進行30 d的檢測，得到20個質控數據，結果顯示，2種精漿生化質控品檢測結果均分布在±2s范圍內，CV的變化均在10%以內。2個組CV差異無統計學意義（P＞0.05），即2個組質控品均可滿足日常質控要求。2個組質控品精漿中性α-葡萄糖苷酶項目批間精密度（CV）均優于精漿果糖項目。見表3。

表3 精漿生化質控品常規檢測結果比較

2.4 A組、B組質控品長期室內質控檢測情況

A組質控品均一性、穩定性均較好，可用于日常質控檢測。靶值和s的設定為日常檢測前累計30 d的數據，使用A組質控品進行為期6個月的室內質控檢測，共累計116個數據點；使用B組質控品進行為期4個月的室內質控檢測，共累計97個數據點，其中A組2個項目CV的變化均＜15%，B組質控品2個項目的CV均高于A組，精密度與A組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 精漿生化質控品常規檢測結果對比

3 討論

隨著輔助生殖技術的迅速發展，目前開展精漿生化項目檢測的男科實驗室數量急速增多，在為臨床診斷提供更多選擇的同時，隨之而來的問題是精漿生化項目檢測在質量控制上的短板。室內質控是保證實驗室檢測質量非常重要的一個環節，均勻、穩定的質控品非常重要。目前，國內商品化精漿質控品存在價格高、使用周期短的問題，男科實驗室自制精漿質控品有較大的意義。

理想的臨床化學檢驗質控品應具備有人源基質特征、無傳染性、添加劑和調制物的數量盡可能少、瓶間變異小、穩定時間足夠長等特點[6]。本研究自制精漿生化質控品均為人源精液，避免了基質效應，樣本選擇無傳染性的樣本，僅添加丙三醇作為調制物，均一性和穩定性均良好，滿足自制質控品的全部要求。本研究在添加丙三醇的同時對質控品的濃度進行了調節，A組中加入質控品體積30%的丙三醇，故其檢測值均低于B組的30%；通過調節精漿原液的取用量，可以獲得不同濃度的質控品。本研究良好的均一性驗證結果證實了精液選擇與分裝方法的有效性。精液液化不良會導致儀器檢測時出現吸樣不足或失敗，從而產生隨機誤差。本研究在分裝混合精漿時時刻保持混勻狀態，采用邊使用一次性吸管反復吹打邊混勻邊分裝的方法，直至分裝完畢，以保證各管質控品的均一性，結果顯示，該方法配制的精漿生化質控品的均勻性好，穩定周期更長，可減少配制次數，以縮小質控品批間差帶來的偏移。

精漿富含糖類、脂類和蛋白質，保持其中有活性的酶類的穩定是制備精漿生化質控品需關注的問題。本研究的穩定性驗證結果顯示，A組精漿果糖項目在29 d內于-20℃保存穩定性較好，精漿中性α-葡萄糖苷酶在85 d內于-20℃保存穩定性較好，A組質控品2個項目的穩定性均優于B組，與張志強等[4]將丙三醇用于酶蛋白類檢測項目的質控品穩定性較好的結果一致。本研究分別對加入丙三醇配制的精漿質控品和未加入任何穩定劑的精漿原液質控品進行比較，以期能夠評價更易普及的精漿生化質控品配制方法，為男科實驗室室內質控的常規開展提供更優的選擇。丙三醇通常用于室間質評樣本保存，本研究結果顯示，質控品內添加丙三醇作為穩定劑可使質控品穩定1個月左右，這對于室間質評樣本檢測和結果回報后的復測分析來說是足夠的。開展精漿生化項目室間質評需考慮質控品在常溫運輸條件下的穩定性，后續將模擬常溫下運輸對于質控品穩定性的影響，以便于開展大范圍的室間質評。

CV是重要的室內質控參數。本研究結果顯示，精漿果糖項目的批間精密度較精漿中性α-葡萄糖苷酶大，原因可能是丙三醇的化學結構有利于維持中性α-葡萄糖苷酶的穩定，而對于糖類的穩定作用不明顯，且果糖化學結構中的羥基易被氧化，較蛋白類的結構穩定性較差。本研究30 d常規質控數據顯示，A組和B組精漿果糖項目的CV均＜10%，精漿中性α-葡萄糖苷酶的CV均＜5%，2個組CV的差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究A組質控品6個月監測數據顯示，2個項目的CV均＜15%，滿足英國男科學會提出的精液分析CV應＜20%的要求[7]，提示質控品的精密度較好。本研究中，日常質控數據中存在超出2s的數據點，可能為試劑或質控品存在瓶間差引起的偶然誤差，后續進行質控檢測時，應對試劑配制、質控品開瓶等操作信息進行記錄，以便回顧異常質控數據，并分析原因，同時加強人員培訓，推行標準化操作，減少誤差。隨著質控品使用時間的延長，本研究數據點離散度有所增大，這與質控品的穩定性隨時間延長而下降有關，但仍然控制在可接受范圍內，但究竟穩定期有多長，尚需要更長時間的室內質控監測。

綜上所述，直接使用精漿原液作為日常質控也能夠滿足室內質控的要求，但需要頻繁更換質控品配制批次，調整靶值，不利于室內質控的長期監測。使用丙三醇作為穩定劑制備質控品，并以丙三醇作為稀釋液調節質控品所需的濃度水平，可滿足室內質控要求。實驗室應制定質控品制備的標準操作規程，保證較小的瓶間差異，從而滿足男科實驗室室內質控的需求。