不同應(yīng)激時間對大鼠抑郁樣行為及腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的動態(tài)變化

陳雅潔 李月峰

重度抑郁癥(major depressive disorder，MDD)是一種慢性疾病，會對人的心理社會功能產(chǎn)生重大影響[1]。目前抑郁疾病發(fā)病機制尚未完全明確，主流假說包括單胺類遞質(zhì)假說、炎癥假說、應(yīng)激假說、神經(jīng)可塑性假說等[2]。其中以小膠質(zhì)細胞激活為特征的神經(jīng)炎癥假說在疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著越來越重要的角色。研究結(jié)果表示，持續(xù)應(yīng)激或感染等病理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞會被過度激活，此時會級聯(lián)反應(yīng)放大炎癥過程，這不僅導致腦內(nèi)炎性細胞因子水平增高，而且導致神經(jīng)元損傷和丟失[3]。

18kDa轉(zhuǎn)位蛋白(18-kDa translocator protein，TSPO)是一種線粒體外膜蛋白，是廣泛應(yīng)用于神經(jīng)炎癥的標志物，它在激活的小膠質(zhì)細胞中特異性上調(diào)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥與MDD患者扣帶回皮質(zhì)、海馬、前額葉、島葉等腦區(qū)TSPO結(jié)合率升高有關(guān)[5,6]。TSPO的放射性配體18F-DPA-714能標記腦區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細胞的激活從而反映出炎癥的發(fā)生、發(fā)展[7]。同時18F-FDG能反映腦區(qū)能量代謝隨時間的變化，但尚未見神經(jīng)炎癥發(fā)生與腦區(qū)代謝相關(guān)性的研究報道。正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography，PET)示蹤劑的發(fā)展，可以在在體水平監(jiān)測在疾病進展過程中的生物事件，為在體內(nèi)研究MDD提供了一種無創(chuàng)的方法[8]。本研究擬采用18F-DPA-714與18F-FDG相結(jié)合動態(tài)采集大鼠抑郁建模過程中PET神經(jīng)炎癥與能量代謝數(shù)據(jù)，旨在分子影像學層面揭示抑郁模型中腦區(qū)炎癥的變化與腦區(qū)代謝的關(guān)系。

材料與方法

1.實驗動物：選用清潔級成年健康SD大鼠20只，體質(zhì)量為180～220g，由江蘇大學實驗動物中心提供(實驗動物許可證號： 2021.35188)。實驗前自由攝取水、食物，保持自然晝夜節(jié)律，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周并對其進行行為學評分。

2.分組與CUMS模型建立：將20只大鼠隨機分成兩組，即對照組(n=10)和模型組(n=10)，模型組單籠飼養(yǎng)，對照組每籠10只。模型組采取禁食、禁水24h，傾斜鼠籠45°，電擊足底1min，懸尾3min，冰水(4℃)游泳5min，晝夜顛倒，熱水(45℃)游泳5min，噪聲刺激3min及潮濕鼠籠24h等9種不同刺激，實驗方法根據(jù)孫美芳等[9]改進，每天隨機采取1種方式，共持續(xù)6周。在實驗前及第2周末、第4周末及第6周末行相應(yīng)行為學檢測及PET/CT掃描，其中18F-DPA-714和18F-FDG掃描間隔24h。行為學檢測結(jié)果顯示，于第6周建模成功。

3.抑郁大鼠模型體質(zhì)量及行為學檢測：(1)體質(zhì)量檢測：應(yīng)激開始前，在合適的環(huán)境中依次測量所有大鼠體質(zhì)量。應(yīng)激開始后在第2、4、6周末于喂食前在相同的環(huán)境中對每只大鼠體質(zhì)量進行測量。(2)蔗糖偏好：實驗前，先對大鼠進行適應(yīng)性訓練3天，即在籠內(nèi)放置兩個瓶子，一個裝有1%蔗糖水，另一個裝有常規(guī)飲用純水，兩個瓶子的位置每天都會交換(從左到右，從右到左)。適應(yīng)性訓練結(jié)束后禁食、禁水24h。鼠籠內(nèi)準備2瓶常規(guī)飲用純水與1%的蔗糖水。待1h后結(jié)束實驗，記錄大鼠總的液體消耗量、飲用純水與蔗糖水攝取量。結(jié)果判定：糖水偏好值(%)=[糖水攝取量/(糖水攝取量+純水攝取量)]×100%。(3)強迫游泳：在測試前1天對大鼠進行預實驗：將大鼠置于透明圓筒(高25cm，直徑15cm，水溫25±2℃，水深20cm)中，預測時長為15min，隨后取出、擦干放入籠中。測試當天，將大鼠再次放入相同的環(huán)境進行測試，測試時長6min。結(jié)果判定：對每一只大鼠測試的后4min進行記錄，記錄在水中保持“不動狀態(tài)”的時間。

4.microPET-CT成像：(1)18F-FDG顯像：大鼠禁食8h后，對大鼠進行稱重，采用異氟烷進行麻醉(麻醉劑量5min/L，維持劑量2min/L)。Inveon Micro-PET掃描儀進行掃描，頭先進，俯臥位標準軸位。通過尾靜脈注射18F-FDG(0.2ml/100g,3.7～5.5MBq)采集能量代謝圖像。PET圖像采集參數(shù)如下：層厚0.78mm， 矩陣128×128，采集時間20min，采集能窗(350～650)kV。CT掃描參數(shù)如下：電壓80kV，電流80mA，層厚1mm，采集時間10min。(2)18F-DPA-714顯像：對大鼠進行稱重，采用異氟烷進行麻醉(麻醉劑量5min/L，維持劑量2min/L)。Inveon Micro-PET掃描儀進行掃描，頭先進，俯臥位標準軸位。通過尾靜脈注射18F-DPA-714(0.2ml/100g,3.7～5.5MBq)后動態(tài)掃描1h。掃描參數(shù)如下：層厚1mm，矩陣128×128，電流500μA，電壓80kV，采集能窗(350～650)kV。

5.圖像分析：18F-FDG采集的數(shù)據(jù)經(jīng)衰減校正后采用三維有序子集最大期望值法(three dimensional ordered subsets expectation maximum，3D-OSEM)進行重建。18F-DPA-714動態(tài)采集的數(shù)據(jù)通過以下分幀方式重組：6×10s、4×60s、5×300s、3×600s，將各幀數(shù)據(jù)圖像用最大后驗估算法(maximum a posterior，MAP)，3D-OSEM進行重建，通過INVEON軟件分析。將重建的PET/CT測量結(jié)果與大鼠腦MRI模板圖譜手動對齊。選擇不同的腦區(qū)作為感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，得到ROI在不同時間點(5s、15s、25s、35s、45s、55s、90s、150s、210s、270s、450s、750s、1050s、1350s、1650s、2100s、2700s和3300s)攝取值，并最終得出SUVmean。

結(jié) 果

1.應(yīng)激時間對大鼠體質(zhì)量及行為學指標影響：在應(yīng)激過程中，對照組與模型組各階段的體質(zhì)量及行為學指標的變化被測量并記錄。結(jié)果顯示，隨著應(yīng)激時間延長，模型組大鼠體質(zhì)量逐漸增加但低于對照組(P<0.05)，行為學指標不動時間延長，糖水偏好值下降。其中，應(yīng)激第2周末時，僅體質(zhì)量變化差異有統(tǒng)計學意義(體質(zhì)量：P<0.05，圖1A；不動時間：P>0.05，圖1B；糖水偏好值：P>0.05，圖1C)。而應(yīng)激第4周、第6周末，體質(zhì)量及行為學進一步變化,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

圖1 兩組不同時間點大鼠體質(zhì)量及行為學結(jié)果比較與同時間點對照組比較，*P<0.001

2.應(yīng)激過程中18F-DPA-714動態(tài)變化和18F-FDG動態(tài)變化：為了探索模型組大鼠腦區(qū)神經(jīng)炎癥變化及代謝關(guān)系，在應(yīng)激過程中，腦內(nèi)神經(jīng)炎癥水平(18F-DPA-714)和代謝(18F-FDG)被同期檢測記錄。對照組大鼠腦區(qū)結(jié)構(gòu)顯示清晰，代謝和炎癥攝取放射性分布均勻。模型組應(yīng)激2周后，僅海馬和前額葉18F-DPA-714 SUVmean出現(xiàn)變化(P<0.05)，而18F-FDG SUVmean未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05)。應(yīng)激4周后，扣帶回皮質(zhì)和島葉出現(xiàn)18F-DPA-714 SUVmean上升和18F-FDG SUVmean下降，同時第4周海馬和前額葉18F-DPA-714 SUVmean較第2周進一步升高，18F-FDG SUVmean進一步下降。應(yīng)激6周后，海馬、前額葉、扣帶回皮質(zhì)和島葉較第4周18F-DPA-714 SUVmean進一步升高，18F-FDG SUVmean水平較第4周進一步下降。不同組18F-DPA-714與18F-FDG攝取值變化詳見表1。模型組18F-DPA-714和18F-FDG海馬攝取圖詳見圖2和圖3。

表1 兩組不同時間點大鼠腦區(qū)18F-DPA-714和18F-FDG SUVmean比較

圖2 不同時間點模型組大鼠海馬18F-DPA-714攝取變化PET-CT顯示隨著應(yīng)激時間的變化，模型組海馬中的18F-DPA-714 SUVmean值逐漸升高

圖3 不同時間點模型組大鼠海馬18F-FDG攝取變化 PET-CT顯示隨著應(yīng)激時間的變化，模型組海馬中的18F-FDG SUVmean值逐漸下降

3.18F-DPA-714與18F-FDG相關(guān)性：進一步分析炎性水平和代謝水平之間的變化，結(jié)果顯示，在給予應(yīng)激4、6周后，扣帶回皮質(zhì)、海馬、前額葉、島葉的炎性水平和代謝變化趨勢相反。進一步相關(guān)分析表明，僅在第6周后，以上腦區(qū)的代謝(18F-FDG SUVmean)與炎性水平(18F-DPA-714 SUVmean)呈負相關(guān)(海馬r=-0.64，P<0.05；前額葉r=-0.75，P<0.05；扣帶回皮質(zhì)r=-0.73，P<0.05；島葉r=-0.67，P<0.05；圖4)，而在第4周后，未出現(xiàn)顯著的相關(guān)性(P均>0.05)。

圖4 應(yīng)激6周后18F-DPA-714和18F-FDG SUVmean在不同腦區(qū)(海馬、前額葉、扣帶回皮質(zhì)、島葉)分布相關(guān)性(n=10)

討 論

本研究以抑郁大鼠為主要研究對象，采用PET-CT掃描技術(shù)非侵入性動態(tài)檢測大鼠模型中神經(jīng)炎癥(18F-DPA-714)與代謝(18F-FDG)異常分布的腦區(qū)同時對其兩者進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，在應(yīng)激第2周后海馬、前額葉18F-DPA-714 SUVmean開始增加，第4、6周進一步增加?？蹘Щ仄べ|(zhì)和島葉在應(yīng)激第4周后18F-DPA-714 SUVmean開始增加，第6周進一步增加。同期在這些腦區(qū)中18F-FDG SUVmean逐漸下降，這與相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)炎癥變化趨勢具有一致性，相關(guān)性分析顯示，僅在第6周相關(guān)腦區(qū)18F-DPA-714和18F-FDG攝取之間有顯著相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)腦區(qū)的炎癥變化稍早于代謝的變化，并且神經(jīng)炎癥累積進一步導致了代謝的改變，基于PET-CT有望對非侵入性量化神經(jīng)炎癥和代謝提供重要的影像學依據(jù)。

近年來，抑郁癥的炎癥假說受到了廣泛關(guān)注。大量研究表明，抑郁癥可能與小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)炎癥有關(guān)[4]。神經(jīng)炎癥是對組織損傷的一種先天免疫反應(yīng)，在包括精神疾病在內(nèi)的許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要作用，并被認為是MDD的啟動、復發(fā)和發(fā)展的原因[10]。筆者在臨床研究中常用CUMS抑郁大鼠模型與孤養(yǎng)模式相結(jié)合能有效模擬人類抑郁癥的核心癥狀，同時此過程也是模擬人類從正常狀態(tài)逐步達到抑郁狀態(tài)，并隨病程延長而發(fā)生病理生理變化的過程[11]。

目前，多種影像學技術(shù)對腦部疾病結(jié)構(gòu)和功能起到了重要作用，就抑郁癥而言，對其發(fā)病機制、病理生理機制提供了客觀依據(jù)[12]。MDD特征是至少有一次重度抑郁發(fā)作，持續(xù)至少2周，其臨床表現(xiàn)復雜，并與分子、代謝和炎癥改變相關(guān)[13]。TSPO在活化的小膠質(zhì)細胞高度表達，這使其成為神經(jīng)炎癥的潛在靶點[4]。因此，PET等功能性神經(jīng)影像學技術(shù)被廣泛應(yīng)用于在體內(nèi)非侵入性追蹤小膠質(zhì)細胞的激活，并可作為一系列病理條件下神經(jīng)炎癥的生物學標志物，包括MDD[14]。大量研究結(jié)果表明，在MDD患者中，海馬結(jié)構(gòu)、前額葉皮質(zhì)、扣帶回皮質(zhì)和島葉TSPO特異性上調(diào)，這與筆者的研究結(jié)果一致[5,6]。

Wang等[15]研究表明，小膠質(zhì)細胞的激活介導了慢性不可預見性輕度應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)誘導的抑郁和焦慮樣行為和海馬神經(jīng)炎癥，并且在給予米諾環(huán)素后抑制了海馬小膠質(zhì)細胞的激活，減少了CUMS誘導的抑郁樣行為。此外，米諾環(huán)素還抑制了促炎性細胞因子的表達，提示小膠質(zhì)細胞誘導的神經(jīng)炎癥可能在CUMS誘導的抑郁樣行為的發(fā)病機制中起重要作用。Zhu等[16]研究證明，首發(fā)抑郁癥患者海馬18F-FDG攝取能力下降，同時代謝能力也下降，始終表現(xiàn)為輕度攝取，緩慢代謝的過程。并且另有研究表明，低糖低代謝與患者的認知功能的下降有關(guān)[9]。然而，既往研究大多數(shù)為橫斷面研究，難以對神經(jīng)炎癥及代謝的變化形成連續(xù)性觀察。此外，對于神經(jīng)炎癥與代謝之間的動態(tài)變化及其兩者的相關(guān)性的研究有也鮮有報道。在本項研究中，體內(nèi)18F-DPA-714及18F-FDG PET-CT組合方法被用于評估CUMS誘導的抑郁模型中腦區(qū)神經(jīng)炎癥及能量代謝，并且在之前研究上進一步探究神經(jīng)炎癥與能量代謝的潛在關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)特征性腦區(qū)炎癥的富集有可能最終導致代謝的異常。

本研究仍有不足之處，例如樣本量偏小，這在一定程度產(chǎn)生了偏倚。在今后的研究中，筆者將進一步擴大樣本量予以證實。