晚期肺腺癌IASLC分級和TTF-1蛋白表達與不同治療方案療效和患者預后的相關性

陳君平 程蘭蘭 王 健 徐 軍

盡管基于影像學和病理診斷的TNM分期是目前指導肺癌治療、判斷預后的主要依據，但仍不能精確判斷腫瘤的生物學特性及分子水平變化[1]。同一分期接受相同治療的患者生存個體差異很大，提示存在其他獨立于傳統TNM分期的影響預后的因素，探尋這些影響化療及靶向治療療效和預后的分子標志物表達特征，有助于更好地開展肺癌的個體化治療。2021年第5版WHO肺腫瘤組織學分類中新增了IASLC(International Association for the Study of Lung Cancer) 肺腺癌分級系統，與肺癌手術切除后較高的復發率和較短的無病生存期有關[2]。甲狀腺轉錄因子1(thyroid transcription factor 1,TTF-1)是診斷肺腺癌最常用的標志物之一，同時也是早期肺癌手術切除后的預后指標，但對TTF-1與晚期肺癌特別是接受不同治療方案的療效判斷和預后的關系研究結果并不一致[3，4]。本研究探討IASLC分級和TTF-1蛋白表達對晚期肺腺癌患者療效和預后的影響，為臨床選擇個體化治療方案提供參考。

對象與方法

1.患者與組織樣本：回顧性分析中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇一醫院2016年1月～2019年12月連續收治的563例確診為肺腺癌患者的臨床資料，臨床分期為ⅢB～Ⅳ期，均接受EGFR、ALK、KRAS基因突變檢測，從中選取EGFR敏感突變陽性、ALK和KRAS基因檢測陰性、接受表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)一線治療的患者114例(EGFR 突變組)，EGFR陰性且接受培美曲塞聯合鉑類藥物一線治療患者119例(EGFR非突變組)。所有入組患者均有完整臨床病理資料，包括年齡、性別、吸煙史等，有足夠的組織活檢標本，隨訪資料完整。按照IASLC分級系統(2021版)進行組織學分級。本研究通過中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇一醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號：202112001)，所有納入患者均簽署知情同意書。

2.基因突變擴增阻滯系統(ARMS法)：人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物公司，所有標本均采用10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，切片厚6～8μm，數量≥10張，應用FFPE樣品DNA分類試劑盒提取DNA，將提取好的DNA稀釋成2ng/μl,按42.3μl稀釋好的DNA模板加入2.7μl Taq酶液混合，分別取5μl加入到預先分裝好的8聯管反應液中，離心后用ABI7500熒光定量PCR儀進行檢測，反應條件：95℃預變性5min，95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，共15個循環；93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，共31個循環；后31個循環60℃收集FAM和HEX信號，數據分析。

3.免疫組織化學染色及結果判定：采用免疫組織化學EliVision二步法。兔抗人TTF-1單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司，石蠟切片脫蠟至水，其余均在BenchMark-GX全自動免疫組化儀(德國羅氏公司)上進行，分別設陽性對照、陰性對照和空白對照。TTF-1陽性定位于細胞核，結果判定參考Zhang 等[5]的方法，以陽性細胞數≥5%為陽性，<5%為陰性。

4.療效評價及隨訪預后分析：分為完全緩解(complete response, CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩定(stable disease, SD)和疾病進展(progressive disease, PD)。客觀緩解率(objective response rate, ORR)=(CR+PR)/全部病例數×100%，疾病控制率(disease control rate, DCR)=(CR+PR+SD)/全部病例數×100%。無進展生存時間(progression-free survival, PFS)的定義為患者從接受治療開始至疾病進展或疾病尚未進展的末次隨訪時間。總生存時間(overall survival, OS)的定義為患者從接受治療開始至死亡或2021年12月31日的時間。隨訪截止日期為2021年12月31日。

5.統計學方法：應用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行統計分析，組間比較采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗,計算患者的PFS和OS，并繪制生存曲線比較生存率。單因素及多因素分析采用COX比例風險回歸分析預后影響因素，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.TTF-1在肺腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系：233例初治ⅢB期或Ⅳ期肺腺癌患者基線特征詳見表1。其中EGFR敏感突變陽性114例，突變類型為19del 53例，L858R 51例，少見敏感突變10例(8%)，包括G719X突變5例，19del和L858R突變3例，L861Q突變1例，L861Q和S768I突變1例。233例患者中TTF-1陽性191例(82%，圖1)，低IASLC組織學分級、EGFR敏感突變、不吸煙患者TTF-1的陽性表達率高于對應組。

圖1 TTF-1在晚期肺腺癌中的表達A.肺腺癌IASLC分級Ⅱ級(HE染色,×100)；B.同一例TTF-1陽性(EliVision二步法,×100)；C.肺腺癌IASLC分級Ⅲ級(HE染色,×200)；D.同一例TTF-1陰性(EliVision二步法,×200)

表1 TTF-1在肺腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

2.TTF-1蛋白表達、IASLC分級對患者不同治療方案近期療效的影響：EGFR突變組中IASLC分級Ⅲ級患者的ORR明顯低于Ⅰ、Ⅱ級患者(P=0.023)，TTF-1陽性患者ORR高于TTF-1陰性患者，但差異無統計學意義(P=0.075)。EGFR非突變組中IASLC分級Ⅲ級患者的ORR亦低于Ⅰ、Ⅱ級患者(P=0.024，表2)。

表2 晚期肺腺癌患者接受不同治療方案的近期療效(n)

3.TTF-1蛋白表達和IASLC分級對患者PFS的影響：COX回歸結果顯示(表3，圖2)，在EGFR突變組和非突變組中IASLC分級Ⅲ級、TTF-1陰性患者PFS均短于相應對照組，并且IASLC分級(P=0.008，HR=1.954,95% CI：1.194～3.200)、突變類型(P=0.003，HR=1.711,95% CI：1.207～2.423)是影響EGFR突變組PFS的獨立因素； IASLC分級(P=0.002，HR=1.928,95% CI：1.263～2.944)、TTF-1表達(P=0.002，HR=2.211,95% CI：1.342～3.641)是影響EGFR非突變組患者PFS的獨立因素。

圖2 IASLC分級、TTF-1蛋白表達與晚期肺腺癌患者PFS的關系

表3 影響晚期肺腺癌患者PFS的COX單因素回歸分析

4.TTF-1蛋白表達、IASLC分級對患者OS的影響：在EGFR突變組、EGFR非突變組中IASLC分級Ⅲ級、TTF-1陰性患者OS均短于相應對照組(表4，圖3)，并且TTF-1表達是影響EGFR突變組(P=0.002，HR=3.727, 95% CI：1.654～8.398)和EGFR非突變組(P=0.005，HR=2.042, 95% CI：1.239～3.365)OS的獨立因素。

表4 影響晚期肺腺癌患者OS的COX單因素回歸分析

圖3 IASLC分級、TTF-1蛋白表達與EGFR突變、無突變患者患者OS的關系

討 論

TTF-1是一種核轉錄蛋白，是診斷肺腺癌最常用的標志物之一，同時也是早期肺癌手術切除后的預后指標[3]。文獻報道，晚期肺癌中TTF-1的表達與患者的化療療效及預后有關，但結果并不一致[4,6～8]。Oktay 等[6]報道200例肺腺癌患者TTF-1表達與OS相關，但該研究入組病例中還包含了25.5%的Ⅰ～ⅢA期患者，部分患者還接受了手術治療，其TTF-1陽性率為67.5%，明顯低于大部分研究報道的陽性率(80%～90%)[9～11]。可能與種族差異導致入組病例中EGFR突變陽性例數太少有關(僅17例)，因為根據以往研究報道和本實驗的結果，TTF-1陽性與EGFR突變呈正相關[5,12,13]。

Park等[4]研究發現，EGFR陰性肺癌中TTF-1表達與患者PFS和OS都相關，但TTF-1陽性和陰性組之間對化療的客觀緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)差異無統計學意義，筆者的研究結果與之基本一致。但也有研究報道，培美曲塞聯合奈達鉑組 TTF-1陽性患者ORR、DCR 均高于TTF-1陰性患者[14]，Misch 等[15]報道，晚期小細胞肺癌TTF-1陽性患者化療反應率相比陰性者高，TTF-1表達可能預測化療療效，TTF-1與肺癌含鉑化療反應率存在聯系，TTF-1表達還可以預測免疫檢查點抑制劑治療的療效[16,17]。Schilsky等[10]研究發現，TTF-1陽性和陰性組使用一線培美曲塞基礎方案化療持續時間無明顯差異，但該研究只是用化療持續時間來評價化療效果，并未分析TTF-1表達與患者PFS的關系。亦有資料顯示，TTF-1陽性者預后相對差[18]。上述分歧提示肺腺癌TTF-1陽性患者在不同化療方案中療效及預后存在差異。本研究探討了TTF-1的表達與晚期肺腺癌患者一線接受培美曲塞基礎化療的療效和預后的關系，結果顯示，TTF-1與患者中位PFS、OS均與TTF-1表達相關，COX回歸分析發現TTF-1表達是影響患者OS的獨立因素，TTF-1表達缺失提示接受培美曲塞基礎化療的患者預后不良。

關于TTF-1對晚期肺癌特別是有EGFR敏感突變并接受EGFR-TKIs治療的預后影響研究較少。本研究結果顯示EGFR敏感突變肺腺癌中TTF-1陽性率為88.6%，陰性組TTF-1陽性率為75.6%，TTF-1陽性與EGFR突變呈正相關，與文獻報道相符[5，12，13]，提示TTF-1的表達可以作為預測患者EGFR突變狀態的分子標志物，如果TTF-1陰性，取材標本有限，則可以考慮優先檢測EGFR之外的其他分子靶點。Zhang等[5]研究了中國人群大樣本資料TTF-1的表達，晚期EGFR突變的肺腺癌中TTF-1的表達與患者PFS相關，但未分析TTF-1的表達與患者接受EGFR-TKIs后OS的關系。本研究結果顯示，TTF-1表達與患者PFS和OS均有關，在EGFR突變組中TTF-1陽性患者ORR高于TTF-1陰性患者，但差異無統計學意義(P=0.075)，可能與入組患者例數太少有關(TTF-1陰性者僅13例)，尚需開展大樣本量前瞻性隨機研究，以明確TTF-1表達對EGFR-TKIs的近、遠期療效預測價值。

本研究結果顯示，無論有無EGFR突變，TTF-1蛋白是預測晚期肺腺癌患者PFS和OS的有效指標，能為臨床醫生在制定個性化的治療方案時提供參考。TTF-1表達影響患者PFS和OS的具體機制仍未完全明確，TTF-1 在生理狀態下參與肺上皮組織發育及分化的調控，同時參與調控腫瘤分化與抑制細胞轉移潛能。肺癌患者TTF-1陽性提示腫瘤尚存在一定程度的正常分化能力，細胞分化相對成熟，侵襲力相對弱。肺腺癌中TTF-1表達與細胞增殖指數ki-67呈負相關，而ki-67與化療患者ORR呈顯著負相關[5, 19]。本研究結果亦顯示，IASLC組織學分級低肺腺癌TTF-1的陽性表達率高于分級高者，說明細胞分化越差，增殖能力越強，TTF-1越容易出現表達缺失，侵襲能力越強，越能抵抗化療和EGFR-TKIs，患者預后越差。

2021年第5版WHO胸部腫瘤組織學分類中新增了IASLC肺腺癌分級系統，Ⅰ級以貼壁樣為主，<20%高級別模式(實性、微乳頭、纖維間質內單個腫瘤細胞浸潤)；Ⅱ級以腺泡狀、乳頭狀為主伴<20%高級別模式；Ⅲ級為任何組織類型伴≥20%高級別模式。既往研究發現，肺腺癌的組織類型如實性、微乳頭狀生長方式與預后差有關，Zhang等[5]研究發現，不同生長模式的EGFR突變的肺腺癌其PFS有差別。Jeon等[2]研究發現，IASLC分級與ⅠA期肺腺癌手術切除的預后有關。Yu等[20]報道高組織學分級肺腺癌患者接受化療ORR明顯低于低分級患者，但研究組選取的是患者的手術切除樣本，優點是能準確全面評估癌組織的生長模式，但并不能完全反映患者發生復發或轉移時的組織學狀態。筆者采用的大多是患者治療前的肺穿刺樣本，結果顯示，無論有無EGFR敏感突變，同IASLC分級為Ⅰ、Ⅱ級患者比較，IASLC分級Ⅲ級患者PFS和OS更短，ORR更低，IASLC分級是預測培美曲塞基礎化療和EGFR-TKIs的療效和預后的簡單有用指標。本研究不足之處在于肺腺癌有一定的異質性，穿刺標本組織量少，評價IASLC分級有一定的局限性。