內質網應激與PI3K/Akt和ERK1/2通路在大鼠宮腔粘連治療中的作用

夏維婷 徐欣欣 周志陽 鄭如如 林 鳳 邊曉麗

宮腔粘連(intrauterine adhesion, IUA)是指由于感染或者損傷等因素引起的子宮內膜的基底層破壞，繼而導致宮腔內形成粘連或者纖維瘢痕。大量研究證明，雌激素可以在哺乳動物的月經期后促進子宮內膜和新生毛細血管的再生[1]。臨床上雌激素治療通常作為宮腔鏡下子宮內膜粘連分離術后的重要輔助治療手段，可以促進受損子宮內膜的再生，防止宮腔粘連的復發[2]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol-3 kinase/Akt, PI3K/Akt)和ERK1/2信號通路是由雌二醇(estradiol, E2)激活的兩個主要的下游信號通路。研究結果證實，這兩個信號通路與細胞的存活、遷移、分化、凋亡存在密切聯系。內質網是細胞內合成蛋白質并進行折疊的場所，許多事件如細胞暴露于氧自由基,內質網中儲存的鈣離子耗竭，都可能導致蛋白質錯誤折疊，觸發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3,4]。近年來研究發現，內質網應激誘導的細胞凋亡在許多疾病發生、發展過程中起重要作用[5]。本研究通過動物實驗證實17β-雌二醇對宮腔粘連大鼠子宮內膜的修復作用，并進一步研究PI3K/Akt和ERK1/2信號通路及內質網應激相關蛋白GRP78和CHOP的表達變化，從而探討它們在宮腔粘連治療中的可能作用。

材料與方法

1.實驗動物：SPF級SD雌鼠18只(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，體質量為230～250g，動物飼養于溫州醫科大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號： SYXK(浙)2015-0009。相關飼養條件：4只SD大鼠同籠飼養，SPF級屏障12h光照/12h黑暗周期變化，室溫保持在22±2℃，濕度維持在35%～60%，保證大鼠能夠自由進食及飲水。

2.藥品和試劑：(1)主要試劑：4%多聚甲醛購自重慶市北碚化學試劑廠，蘇木精-伊紅染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Masson染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，CD31、GRP78、CHOP、Akt1、p-Akt、ERK、p-ERK多克隆抗體購自英國Abcam公司。(2)17β-雌二醇油溶液的配置：17β-雌二醇購自美國Alfa Aesa公司，使用定量的無水乙醇將17β-雌二醇充分溶解后，加入無菌花生油配制成10μg/100μg的17β-雌二醇油溶液備用。

3.實驗儀器：自動酶標分析儀購自美國Bio-Rad公司，多功能顯微鏡購自日本Olympus公司，電泳設備購自美國Bio-Rad公司，電動玻璃勻漿機購自寧波新芝生物科技股份有限公司，病理組織包埋機購自常州中威電子儀器有限公司，BP211D型電子天平購自德國Sartorius公司。

4.IUA動物模型構建及分組：大鼠適應性飼養1周后隨機分為對照組、模型組及治療組，每組各6只。通過機械損傷法構建大鼠宮腔粘連模型，具體方法如下：每日早上8：00時對大鼠行陰道涂片觀察，處于動情間期的雌鼠用于宮腔粘連模型的構建[6,7]。腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉后，大鼠仰臥位固定，腹部剃毛備皮，用碘伏消毒皮膚，在腹部正中線做長約2cm的切口。逐層切開皮膚和肌肉，暴露腹腔，在大鼠膀胱后方尋找子宮。暴露子宮后，在Y形子宮分叉處上方做一0.5cm的切口，利用刮勺刮除子宮內膜至宮腔表面有粗糙感，造成子宮內膜損傷。然后縫合子宮切口，并用無菌紗布仔細止血后，縫合肌層與皮膚。術后給予肌內注射抗生素預防感染。模型組僅建立機械性損傷模型，對照組不做任何干預，治療組造模后當天開始每日皮下注射濃度為10μg/100μg的17β-雌二醇油溶液100μg，連續7天。

5.組織病理學檢測：固定好的子宮組織進行脫水，石蠟包埋，制備成5μm切片，分別進行HE染色觀察子宮內膜形態、Masson染色觀察子宮內膜的纖維化程度、CD31免疫組化染色觀察子宮內膜新生血管的生成情況。

6.Western blot法檢測子宮內GRP78、CHOP、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白：提取組織，采用BCA法進行定量，SDS-PAGE電泳，移膜、封閉后，加入目標一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應的二抗稀釋液室溫孵育2h，滴加ECL發光、顯影，采集條帶吸光度值及面積用于統計分析。以GAPDH條帶作為內參照，計算蛋白表達的相對水平。

結 果

1.大鼠子宮大體及病理形態學變化：對照組大鼠子宮表面呈淡粉色，有良好伸展性；模型組大鼠彈性減退，變細、僵直、甚至發生積液。治療組較模型組子宮粗細均勻，彈性尚可，形態近似對照組(圖1)。HE染色結果顯示，在模型組，子宮內膜表面僅覆蓋一層低柱狀上皮，腺體數量顯著下降，甚至只觀察到個別腺體分布在子宮的黏膜下層和基底層。與模型組比較，給予17β-雌二醇干預后，大鼠子宮內膜的腺體數量有所增加(P<0.01)。Masson染色后可見模型組大鼠的子宮內膜纖維化面積較對照組顯著增加(P<0.01)，而給予17β-雌二醇治療后，子宮內膜纖維化面積的比例降低(P<0.01，圖2)。

圖1 各組大鼠子宮大體形態A.對照組；B.模型組;C.治療組

2.各組大鼠子宮內膜CD31表達情況：與對照組比較，CD31的表達水平在模型組顯著下降(P<0.01)。IUA大鼠給予17β-雌二醇治療后，CD31的表達水平在受損的子宮內膜部位有所上調(P<0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠子宮HE、Masson染色及CD31的表達A～F.各組大鼠子宮內膜HE染色(A～C.×40；D～F.×200)；G～I.各組大鼠子宮內膜Masson染色(×400)；J～L：各組大鼠子宮內膜CD31免疫組化染色(×400)；M.各組大鼠子宮內膜腺體數量的統計圖；N.各組大鼠子宮內膜纖維化面積比的統計圖；O.各組大鼠子宮內膜CD31表達情況的統計圖。*P<0.05，**P<0.01

3.各組大鼠子宮組織中內質網應激相關凋亡蛋白(GRP78、CHOP)及PI3K/Akt和ERK1/2通道相關蛋白的表達情況：與對照組比較，模型組大鼠子宮組織中內質網應激相關凋亡蛋白(GRP78和CHOP)表達顯著升高(P<0.01)，而17β-雌二醇治療后其表達有所降低(P<0.05)。在模型組中，子宮內膜組織磷酸化的Akt和ERK表達水平較對照組顯著下降(P<0.01)，而給予17β-雌二醇治療后，p-Akt和p-ERK的下降情況有所逆轉(P<0.05，圖3)。

圖3 各組大鼠子宮組織中蛋白的表達A.各組大鼠子宮蛋白表達情況；B.各組大鼠子宮GRP78和CHOP蛋白相對表達量的統計分析圖；C.各組大鼠Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白相對表達量的統計分析圖。與對照組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

研究表明，使用生理劑量的雌激素治療宮腔粘連有利于子宮內膜的損傷修復[8，9]。Jolinda等[10]研究認為，無論患者IUA程度如何，雌激素都是有效的，建議復發性IUA患者常規使用雌激素作為圍術期的輔助治療。本研究中HE及Masson染色結果顯示，治療組與模型組比較，子宮內膜腺體數量明顯增加，而子宮內膜纖維化面積明顯減少。CD31免疫組化結果顯示治療組的微血管數量明顯增加，表明17β-雌二醇對子宮內膜損傷有著明顯的改善作用。

近年來，越來越多的研究表明，內質網應激誘導細胞凋亡與疾病的發生、發展密切相關。研究證實，大鼠脊髓損傷后，內質網應激誘導的細胞凋亡相關蛋白，包括GRP78和CHOP都明顯增加[11]。一項關于動脈粥樣硬化的研究也表明，冠狀動脈內皮細胞的功能障礙和損傷與內質網應激相關[12]。也有研究表明，內質網應激與肝臟纖維化呈明顯的相關性[13，14]。然而，內質網應激在IUA的發生、發展中的作用目前還較少被深入研究。本研究發現，內質網應激誘導的細胞凋亡參與了IUA的發生，相關凋亡蛋白的水平在模型組大鼠中顯著增加。而給予17β-雌二醇治療可以抑制相關細胞凋亡蛋白的表達，減少損傷引起的內質網應激，促進子宮內膜再生。

PI3K/Akt和ERK1/2通路作為E2激活的主要下游信號通路，在許多細胞的生理過程中發揮重要作用，如細胞增殖和遷移以及組織的纖維化[15～17]。其中，PI3K/Akt信號通路在促進細胞增殖、抑制細胞凋亡中發揮重要作用[18]。PI3K可使其下游靶蛋白Akt發生磷酸化，進而使糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，因而喪失誘導細胞凋亡的作用；同時p-Akt還可以抑制促凋亡蛋白的合成，從而發揮抑制細胞凋亡的作用[1,19]。研究表明，低劑量E2可以激活大鼠海馬的PI3K/Akt和ERK1/2通路，使磷酸化的Akt和ERK的表達顯著升高，從而促進神經元細胞的存活[20]。本研究中IUA大鼠子宮組織中p-Akt和p-ERK較對照組均顯著下降，而下降的p-Akt和p-ERK在給予17β-雌二醇治療后表達有所上升，提示在IUA中PI3K/Akt和ERK信號通路被抑制，而E2可以激活大鼠子宮內膜的PI3K/Akt和ERK通路。

綜上所述，本研究通過建立SD大鼠機械損傷宮腔粘連模型，驗證了17β-雌二醇能促進子宮內膜的結構修復，從而起到治療作用。本研究證明了內質網應激和PI3K/Akt、ERK1/2通路與子宮內膜損傷修復均呈顯著的相關性，但二者之間的關系尚不明確，其具體的作用機制仍有待于進一步研究。