去亞甲基小檗堿抑制破骨分化減輕鈦顆粒誘導的骨溶解

賈鑫林 毛遠青

人工關節置換術已被廣泛用于治療終末期關節疾病，如嚴重創傷、骨關節炎和股骨頭壞死等[1,2]。當前制約人工關節置換術中遠期臨床效果的主要問題仍是假體無菌性松動，但造成假體無菌性松動的病理機制尚不明確。目前大量研究證實，假體表面的磨損顆粒會激活局部的破骨細胞，促進其分化成熟和功能亢進，同時磨損顆粒會抑制成骨細胞的分化和成骨作用，最終引起假體周圍骨重建失衡和骨溶解，導致假體無菌性松動[3～10]。因此，如果能在早期阻斷磨損顆粒誘導的骨溶解，則能夠有效避免關節翻修術產生的并發癥多、失敗率高等問題，同時還能有效減輕患者經濟負擔，避免二次手術所造成的患者心理創傷。

去亞甲基小檗堿(demethyleneberberine，DMB)是一種從中藥黃柏中提取的異喹啉生物堿，具有抗炎、抗纖維化、抗氧化等多種藥理活性[11～13]。既往研究表明，其是一種天然的線粒體靶向抗氧化劑，可以抑制酒精性肝病模型中的氧化應激、線粒體功能障礙和脂肪變性、減輕小鼠炎癥性腸病等作用[14～16]。然而DMB對破骨細胞分化的影響鮮見報道。因此，本研究通過巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)和核因子-κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)刺激C57BL/6小鼠骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derived macrophages，BMMs)向破骨細胞分化成熟，并以此為基礎探討DMB在小鼠BMMs細胞向破骨細胞分化過程中的作用，同時通過建立鈦(Ti)顆粒誘導的C57BL/6小鼠顱骨骨溶解動物模型探究DMB對骨溶解的影響。

材料與方法

1.實驗試劑：DMB(批號：25459-91-0)購自上海藍木化工有限公司；細胞因子M-CSF、RANKL購自美國R&D Systems公司；Ti顆粒購自美國Johnson Matthey公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Molecular Technology公司；TRAP染色試劑盒、Trizol試劑購自美國Sigma-Aldrich公司；反轉錄試劑盒Prime Script RT Master Mix、qPCR試劑盒SYBR PreMix Ex Taq Kit購自日本TaKaRa公司；NFATc1、TRAP、CTSK、C-Fos、Dc-stamp、GAPDH引物購自生工生物(上海)股份有限公司。

2.實驗動物與分組：4～6周齡雄性C57BL/6小鼠，購自上海市實驗動物中心西普爾-必凱實驗動物有限公司[生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016；使用許可證號：SYXK(滬)2018-0026]。小鼠飼養及動物實驗均在上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物中心進行，動物實驗方案通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號：SH9H-2020-A434-1)。將20只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組(每組5只)。小鼠腹腔注射舒泰(65mg/kg)與鹽酸賽拉嗪(10mg/kg)麻醉。備皮后，將小鼠固定于手術臺，在顱骨正中矢狀縫處切開皮膚，切口長約1cm，以人字縫與矢狀縫的交點為原點，暴露1.0cm×1.0cm面積的顱骨外膜，使用刀片刮去顱骨外骨膜后，在假手術組的顱骨表面注射100μl的無菌0.9% NaCl溶液后關閉切口，在Ti顆粒組、Ti顆粒+低劑量組(1mg/kg DMB)(簡稱低劑量組)、Ti顆粒+高劑量組(10mg/kg DMB)(簡稱高劑量組)的小鼠顱骨表面，將30mg無菌Ti顆粒懸液緩慢均勻滴散在顱骨表面后縫合傷口。根據產品說明書，將DMB重新懸浮在DMSO中，直到完全溶解，然后在磷酸鹽緩沖液中稀釋。低劑量組和高劑量組小鼠按照隔日1次，腹腔注射相應濃度的DMB，連續2周，其余各組均注射相同劑量的0.9%NaCl溶液。2周后對動物進行安樂死，取出顱骨固定，用于后續實驗分析。

3.微計算機斷層掃描(micro computed tomography，Micro-CT)：用4%甲醛固定48h后，仔細清除顱骨表面殘留的鈦顆粒，避免在Micro-CT掃描過程中出現金屬偽影。各組顱骨樣本分別進行Micro-CT掃描，設定參數X線能量分別設置成 80kV及80mA，掃描厚度設置成 9μm，曝光時間設置到100ms。將掃描所得到的二維斷層圖像導出。使用NRecom 對二維斷層圖像進行三維重建，確定范圍為以矢狀縫、人字縫的交點為中心，半徑5mm進行進一步的定量分析。用CT Analyser軟件(SkyScan)測量骨密度(bone mineral density，BMD，mg/cc)和每個樣本的骨體積與組織體積的比值百分比(BV/TV)。

4.細胞提取與誘導分化：取4～6周齡C57BL/6小鼠，安樂死后浸泡在75%乙醇溶液中消毒20min。隨后分離小鼠的股骨和脛骨，剪斷干骺端后，使用1ml注射器吸取細胞培養基反復沖洗股骨和脛骨的骨髓腔。將沖洗獲得的含有骨髓細胞的培養基離心后，使用含有30ng/ml的M-CSF完全培養基中，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的細胞培養箱中培養5天，期間更換培養液1次，所得的貼壁細胞即為原代BMMs細胞。

5.細胞毒性分析：將BMMs細胞按照1×104個/孔的密度種植于96孔板中，在孔中加入含有不同濃度的DMB的培養基(0、5、10、15、20、30、40、50μmol/L)進行一定時間的培養。分別于48、96h后，吸除孔中的培養基，每孔加入100μl含有10%CCK-8試劑的無血清培養基，并在培養箱中內繼續培養2h，隨后使用酶標儀檢測在450nm波長下孔內的吸光度(A)值。

6.抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色：將培養得到的BMMs細胞利用胰酶消化后重懸、計數，按照每孔8×103個/孔的密度接種于96孔板中，使用含有30ng/ml的M-CSF完全培養基培養24h。24h后，使用含有30ng/ml的M-CSF和50ng/ml的RANKL的完全培養基，并添加不同濃度的DMB(0、10、20、40μmol/L)，培養5天進行鏡下觀察，當發現空白對照組內的BMMs細胞融合成為多核巨細胞時，使用TRAP染色試劑盒進行染色。具體染色方法為：吸除96孔板內殘留的培養基，用磷酸鹽緩沖液清洗3次充分取出殘留的培養基；隨后每孔加入30μl的4%多聚甲醛，于室溫下固定細胞10min；10min后吸除孔內的固定液，并使用磷酸鹽緩沖液清洗3次，去除孔內殘留的固定液；按照TRAP染色試劑盒，每孔加入100μl染色液，在避光條加下37℃恒溫箱中孵育2h；2h后吸除染色液，再次使用磷酸鹽緩沖液清洗3次。最后，于光學顯微鏡下觀察統計，細胞核≥3個的即為TRAP染色陽性細胞。

7.實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測：將重懸計數獲得的BMMs細胞，按照1×105個/孔的密度種植于6孔板中，加入含有不同濃度的DMB破骨細胞誘導完全培養基(30ng/ml的M-CSF和50ng/ml的RANKL)，在培養箱內培養5天，提取RNA。提取方法：首先吸除6孔板內的培養基，并用磷酸鹽緩沖液清洗3次，隨后每孔加入1ml 的Trizol裂解液，用移液槍反復吹打孔中細胞，并放置于冰上再充分裂解5min；將充分裂解的樣品轉移至1.5ml的離心管中，加入0.2ml的氯仿，漩渦震蕩混勻15秒，室溫放置2～3min；按照4℃、12000×g條件，離心15min后，吸取上清，加入0.5ml異丙醇混合均勻，隨后4℃、12000×g條件下，離心15min，舍棄上清液；加入75%乙醇，4℃、7500×g條件下，離心5min，棄上清，靜置5min；每個離心管中加入20μl的DEPC水溶解RNA；最后用微量核酸濃度測定儀來測定RNA的濃度和純度，A260/A280在1.8～2.0為最佳。隨后使用反轉錄試劑盒進行反轉錄反應(37℃ 15min；70℃ 10min)，得到cDNA。使用cDNA與破骨分化相關基因引物(NFATc1、TRAP、CTSK、C-Fos、Dc-stamp)進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應，并使用GADPH作為內參基因。引物序列如下：TRAP上游引物：5′-CTGGAGTGCACGATGCCAGCGACA-3′，下游引物：5′-TCCGTGCTCGGCGATGGACCAGA-3′；NFATc1上游引物：5′-CCGTTGCTTCCAGAAAA-TAACA-3′，下游引物：5′-TGTGGGATGTGAACTCGGAA-3′；C-Fos上游引物：5′-CCAGTCAAGAGCATCAGCAA-3′，下游引物：5′-AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA-3′;CTSK上游引物：5′-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3′，下游引物：5′-TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC-3′;Dc-stamp上游引物：5′-GTGGAGAGCAAGGAACCCAA-3′，下游引物：5′-TCAGACACACTGAGACGTGG-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物5：′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。

8.統計學方法：應用SPSS 26.0統計學軟件對數據進行統計分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.DMB在Ti顆粒誘導的骨溶解中的治療作用：Micro-CT三維重建圖像顯示(圖1A)，假手術組小鼠顱骨表面光滑無侵蝕，而Ti顆粒組，小鼠顱骨被廣泛侵蝕，甚至部分骨連接中斷。而低劑量組和高劑量組小鼠顱骨表面侵蝕逐漸減輕。此外，與假手術組比較，Ti顆粒組骨密度和BV/TV百分比顯著降低(圖1B和圖1C)，低劑量組和高劑量組小鼠顱骨的骨密度、BV/TV百分比均有提高(圖1B和圖1C)。由此可知DMB能夠抑制Ti顆粒誘導的小鼠顱骨骨溶解。

圖1 Ti顆粒誘導的小鼠顱骨溶解Micro-CT掃描三維結果A.Micro-CT三維重建圖像；B.骨密度結果;C.BV/TV的百分比。*P<0.001

2.DMB對BMMs細胞無明顯細胞毒性：CCK-8檢測結果表明，DMB對BMMs細胞的增殖無明顯的抑制作用。雖然在48h(圖2A)的CCK-8檢測結果DMB在濃度為40、50μmol/L對BMMs細胞有輕微毒性，但72h和96h(圖2中B和C)檢測結果表明，DMB濃度在50μmol/L以下不會對BMMs細胞產生細胞毒性，因此DMB也不會在破骨細胞分化成熟過程產生干擾。

圖2 CCK-8檢測DMB對BMMs的細胞毒性A.48h破骨細胞吸光度值;B.72h破骨細胞吸光度值;C.96h破骨細胞吸光度值。與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3.DMB體外抑制BMMs細胞向破骨細胞分化：BMMs細胞在M-CSF和RANKL的誘導下能夠分化并融合成為破骨細胞，表現為TRAP染色陽性(圖3 A)。然而在DMB的作用下，BMMs細胞向破骨細胞分化過程被明顯抑制，具體表現為TRAP染色陽性細胞數目減少和破骨細胞面積百分比降低，并且這一抑制作用隨著DMB濃度的提高而增強(圖3)。值得注意的是，DMB 不僅在低濃度下對破骨細胞分化有抑制作用，在高濃度下(40μmol/L)DMB對破骨細胞分化抑制作用顯著增強，TRAP染色陽性細胞數量和面積都顯著性下降(P<0.001，圖3)。因此，根據TRAP染色結果可以得出，DMB能夠有效抑制破骨細胞的分化成熟。

圖3 不同濃度DMB下BMMs細胞TRAP染色A.0μmol/L DMB；B.10μmol/L DMB；C.20μmol/L DMB；D.40μmol/L DMB；E.每孔破骨細胞數量； F.每孔破骨細胞面積百分比。與0μmol/L組比較，*P<0.01，**P<0.001

4.DMB體外抑制RANKL誘導的破骨細胞相關基因表達：破骨細胞相關基因的上調在破骨細胞分化過程中起著重要作用。為了進一步評估DMB對破骨細胞生成的影響，筆者探究DMB能否抑制RANKL誘導的破骨細胞相關基因的表達，包括NFATc1、C-Fos、TRAP、CTSK和Dc-Stamp。熒光定量PCR結果顯示，在RANKL刺激后，上述相關基因的mRNA表達量升高。然而，RANKL誘導破骨細胞相關基因的作用被DMB以劑量依賴的方式明顯抑制(圖4)，這與TRAP染色結果一致，表明DMB在體外對RANKL誘導的破骨細胞相關基因表達具有抑制作用。

圖4 BMMs在RANKL和不同濃度的DMB誘導后的相關基因表達情況A.C-Fos mRNA；B.CTSK mRNA；C.NFATc1mRNA；D.Dc-Stamp mRNA；E.TRAP mRNA。與DMB 0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

討 論

人工關節置換術是治療終末期關節疾病的有效方法[1]。然而，繼發于假體周圍骨溶解(peri-implant osteolysis，PIO)的無菌性松動是人工關節置換失敗的主要原因[2～4]。雖然植入物的設計和材料已有很大改進，但并不能有效減少假體植入后磨粒顆粒的產生。相關研究證實，磨損顆粒引起的局部炎性反應會激活假體周圍的破骨細胞，促進其分化成熟和功能增強，進而導致假體周圍骨溶解增加[17, 18]。因此，抑制破骨細胞的功能是治療假體周圍骨溶解的有效手段。目前，許多已知的能夠抑制破骨細胞功能的藥物，如雙膦酸鹽，雷尼酸鍶和紅霉素，已被證明可緩解磨損顆粒誘導的骨溶解[19]。然而這些藥物會造成許多不良反應，如發熱、胃潰瘍、下頜骨壞死等，同時由于上述藥物生物利用度的局限性，阻礙了它們長期用于PIO的治療。DMB作為一種從中藥黃柏中提取的異喹啉生物堿，已被證實具有良好的抗炎和抗氧化作用[20]。鑒于此，筆者認為DMB能夠通過其抗炎作用抑制磨損顆粒誘導的破骨細胞分化成熟和骨溶解。

本研究通過提取C57BL/6小鼠骨髓源性巨噬細胞，利用M-CSF誘導其分化為破骨細胞前體細胞，并在RANKL的作用下誘導其分化為成熟的破骨細胞，隨后利用DMB研究其對破骨細胞分化影響，并通過腹腔注射不同劑量的DMB研究其對Ti顆粒誘導的小鼠顱骨的骨溶解抑制作用。CCK-8實驗結果表明DMB具有良好的生物相容性，對小鼠BMMs細胞無明顯的毒性不良反應。通過TRAP染色結果表明，DMB能夠明顯抑制破骨細胞的分化和破骨細胞數目，并且隨著DMB使用濃度的提高，這一抑制作用明顯增強。隨后通過RT-qPCR進一步驗證了DMB能夠抑制破骨細胞分化相關基因的表達，從而表面DMB能夠從基因水平上抑制破骨細胞分化。最后，通過體內建立Ti顆粒誘導的小鼠顱骨骨溶解模型，在使用不同劑量的DMB治療2周后，Micro-CT掃描及分析結果證明DMB能夠抑制Ti顆粒誘導的小鼠顱骨骨溶解。綜合以上結果，證明DMB能夠抑制破骨細胞分化和Ti顆粒誘導的骨溶解。

綜上所述，骨代謝是破骨細胞性骨吸收和成骨細胞性骨形成之間的平衡，骨形成在治療骨溶解方面也起著重要作用。目前尚未探索DMB對成骨細胞是否存在一定的作用，進而影響骨形成，這些將在未來的研究中予以進一步探索。本研究只初步探索了DMB對破骨細胞的抑制作用，其抑制破骨細胞的具體機制有待于進一步研究，期待其能夠在未來成為治療骨關節疾病的一種新型中藥藥物。