間充質(zhì)干細(xì)胞治療自閉癥的研究進(jìn)展①

楊淑鈞 申 晨 李 萌 曹 霞 （昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室，昆明 650101）

自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）是一種異質(zhì)性精神發(fā)育障礙性疾病，其基本特征是社交技能和認(rèn)知靈活性嚴(yán)重受損［1］。男孩患自閉癥的概率比女孩高3～4倍。根據(jù)美國相關(guān)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近10年來，自閉癥患病率由1/125上升至1/59，而我國自閉癥患者數(shù)量也在逐年攀增，僅6～12歲兒童中ASD患者數(shù)量就高達(dá)70～100萬例，ASD被認(rèn)為是增長最快的發(fā)育障礙性疾病［2］。但由于ASD是多因素導(dǎo)致的，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，患者在癥狀、智力水平、嚴(yán)重程度和功能障礙方面差異很大，因此至今無法治愈。現(xiàn)有的常規(guī)干預(yù)措施療效有限，促使研究者們在細(xì)胞和分子水平上尋找針對ASD病變的生物學(xué)療法［3］。干細(xì)胞移植對于患有無法治愈的腦部疾病的患者具有良好的治療潛力，且有研究表明細(xì)胞移植可能影響與ASD相關(guān)的病理生理機(jī)制，因此提出了基于干細(xì)胞的再生療法來治療ASD。而間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是臨床研究中最常用的細(xì)胞，具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)功能、旁分泌再生功能、神經(jīng)保護(hù)作用等，可通過誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)治療腦部疾病、增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生、提高神經(jīng)營養(yǎng)因子水平，且其來源豐富，采集方便，免疫原性低，這些都體現(xiàn)了其治療ASD的潛力［4-5］。本文總結(jié)了近年來通過移植MSCs治療自閉癥的研究結(jié)果，為采用MSCs治療自閉癥提供重要線索。

1 自閉癥的治療現(xiàn)狀

由于自閉癥本身發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，導(dǎo)致患者在發(fā)病癥狀、嚴(yán)重程度上差異很大，因此只能根據(jù)其核心癥狀和相關(guān)癥狀進(jìn)行觀察性方法和心理檢測診斷。美國出版的《精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊》通常被用作自閉癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)［3］。

對于ASD的治療，現(xiàn)有的治療方法可分為藥理、營養(yǎng)和行為學(xué)方法，但不存在定義的標(biāo)準(zhǔn)方法。藥理學(xué)方法一般針對ASD相關(guān)的神經(jīng)精神癥狀，如易怒和多動等相關(guān)癥狀，常用藥有精神刺激藥、非典型抗精神病藥、抗抑郁藥、抗驚厥情緒穩(wěn)定劑等，但目前尚無藥物被批準(zhǔn)用于治療自閉癥的核心癥狀。其他治療方法包括非精神藥物治療（乙酰膽堿酯酶抑制劑、肉堿、維生素C）、反復(fù)經(jīng)顱磁刺激治療法、激素治療法（褪黑素、催產(chǎn)素和加壓素）、免疫調(diào)節(jié)和抗炎治療。行為治療是自閉癥的有效干預(yù)策略，包括早期強(qiáng)化認(rèn)知行為療法、言語治療、社交技能培訓(xùn)、特殊教育和職業(yè)培訓(xùn)、音樂療法，然而，尚無明確的行為干預(yù)治療方法可完全改善自閉癥患者的所有癥狀［6-8］。如何更好地治療ASD仍需進(jìn)一步研究。

目前，新型治療方法有基因治療和干細(xì)胞治療［3，9］。鑒于ASD患者的免疫失調(diào)，干細(xì)胞療法已被提出并應(yīng)用于自閉癥治療。其中，MSCs所具有的免疫學(xué)特性使其成為治療ASD的候選細(xì)胞。

2 MSCs治療自閉癥的機(jī)制

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞。有研究指出，干細(xì)胞的旁分泌、免疫調(diào)節(jié)作用是治療ASD的潛在機(jī)制［10］。ASD患者是患有精神疾病的群體，其大腦中的神經(jīng)發(fā)生通常緩慢而有限，且ASD患者表現(xiàn)出先天性和適應(yīng)性免疫失衡，其免疫系統(tǒng)通常產(chǎn)生異常且強(qiáng)烈的促炎細(xì)胞因子，這些改變會導(dǎo)致長期免疫失調(diào)［11］；相關(guān)研究表明，ASD患者大腦的某些神經(jīng)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及浦肯野細(xì)胞等）形態(tài)與數(shù)量存在異常［12］。而干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和分化能力可恢復(fù)這些免疫改變和神經(jīng)發(fā)生。因此，在許多研究中，干細(xì)胞被用來治療ASD，并展現(xiàn)出很好的治療效果。

MSCs是干細(xì)胞家族的重要成員，是中胚層起源的祖細(xì)胞群，最早在含量豐富的骨髓中發(fā)現(xiàn)，之后發(fā)現(xiàn)其也存在于胎盤、臍帶、脂肪等組織中，具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化能力，還有免疫調(diào)節(jié)功能、來源方便、易于分離培養(yǎng)、表面抗原不明顯、異體移植排異較輕等特點。目前，MSCs已廣泛運(yùn)用于血液系統(tǒng)疾病、心血管疾病、自身免疫疾病等研究中，在神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)方面具有長遠(yuǎn)的發(fā)展前景，在醫(yī)學(xué)研究中顯示出良好效果［13-14］，許多研究人員將其用來治療ASD，無論是在動物實驗還是臨床研究中，ASD的癥狀都因此得到明顯緩解。

根據(jù)相關(guān)研究，MSCs的以下特點使其成為治療ASD的候選：①刺激宿主受損組織的可塑性反應(yīng)，如炎癥性腸道疾病；②合成和釋放抗炎細(xì)胞因子和促進(jìn)生存的生長因子（旁分泌）；③移植后，MSCs靶向遷移至損傷部位，對局部環(huán)境做出反應(yīng)，如整合到現(xiàn)有的神經(jīng)和突觸網(wǎng)絡(luò)［10，15-16］；④不存在不可控的生長和腫瘤發(fā)生，不引起道德異議［17］。

典型的ASD患者表現(xiàn)出T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能改變，以及CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞失衡，在此基礎(chǔ)上，MSCs介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用，如抑制CD8+/CD4+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖，抑制漿細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，抑制樹突狀細(xì)胞成熟等是恢復(fù)免疫平衡的最佳途徑，這是通過藥物干預(yù)無法獲得的［17］。其次，自閉癥患者中提取的外周血單核細(xì)胞過度產(chǎn)生IL-1β，導(dǎo)致長期免疫改變，而MSCs介導(dǎo)的免疫抑制活性（抑制TNF-α和IFN-γ的產(chǎn)生和增加IL-10水平）可以恢復(fù)這種免疫失衡［15］。另有證據(jù)顯示，自閉癥受試者的小腦浦肯野細(xì)胞數(shù)量減少，而移植的MSCs能夠促進(jìn)突觸可塑性和功能恢復(fù)，并挽救小腦浦肯野細(xì)胞［18-19］。MSCs針對ASD相關(guān)異常改變做出的潛在改善作用如表1所示。

表1 MSCs治療ASD的機(jī)制Tab.1 Mechanism of MSCs for treatment of ASD

3 MSCs治療自閉癥動物模型（BTBR小鼠）的試驗

近交小鼠品系BTBR表現(xiàn)出ASD所有核心癥狀，且有遺傳穩(wěn)定性和商業(yè)可得性，是評估自閉癥樣行為的公認(rèn)動物模型［20］。SEGAL-GAVISH 等［21］采用皮下注射的方式將MSCs移植于BTBR小鼠的側(cè)腦室，以假手術(shù)組為對照，檢測移植后的行為學(xué)變化和病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)MSC移植組的刻板印象行為水平較對照組明顯降低（挖掘時間減少46%，梳理時間減少60%）；MSC組認(rèn)知僵化強(qiáng)度降低，適應(yīng)環(huán)境變化的靈活性提高（水迷宮試驗中的空間學(xué)習(xí)和記憶能力、轉(zhuǎn)輪試驗中的認(rèn)知僵化指標(biāo)改善）；社交互動試驗中，MSC組花費(fèi)更多時間進(jìn)行社交互動（三室試驗）；MSC組的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）較對照組增加36%，齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞增殖增加。2017年P(guān)ERETS等［22］將MSCs分化為能分泌更高水平神經(jīng)營養(yǎng)因子的細(xì)胞（NurOwn?），并將其移植到BTBR小鼠側(cè)腦室，發(fā)現(xiàn)治療后NurOwn?組BTBR小鼠的社交行為得到明顯改善，雌雄間發(fā)聲次數(shù)增加，重復(fù)梳理的時間減少，認(rèn)知靈活性得到明顯改善。首次顯示了可測量的所有行為表型的改善，且具有長達(dá)6個月的長期效果。而近期的另一項研究表明MSCs的治療作用主要是通過分泌包含重要分子信息的囊泡（MSC-exo）介導(dǎo)，該實驗僅對BTBR小鼠使用MSC-exo（鼻內(nèi)給藥）就可明顯改善所有ASD樣癥狀［23］。

4 MSCs治療自閉癥的臨床試驗

鑒于在這種疾病中觀察到的免疫和精神失調(diào)，2013年 LV等［24］研究了人臍帶血單核細(xì)胞（cord blood mononuclear cells，CBMNCs）與臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）聯(lián)合移植治療自閉癥兒童的安全性和有效性，37例（3～12歲）自閉癥患者參加了這項研究（分為CBMNC組、聯(lián)合組及對照組），受試者每周1次靜脈和4次鞘內(nèi)注射干細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)的重大不良反應(yīng)，且最后由兒童自閉癥評定量表（CARS）、臨床總體印象量表（CGI）和異常行為檢查表（ABC）顯示的結(jié)果表示：聯(lián)合移植CBMNCs和UCMSCs的效果優(yōu)于單獨(dú)移植CBMNCs。同年，SHARMA等［25］研究了將含有MSCs的自體骨髓單個核細(xì)胞（BMNC）經(jīng)鞘內(nèi)移植到32例（3～33歲）自閉癥患者體內(nèi)的療效，經(jīng)26個月的隨訪，發(fā)現(xiàn)96%的患者在各種行為量表上的得分均有所改善，體現(xiàn)出患者情緒反應(yīng)、交流、認(rèn)知及行為模式等方面的改善，但同時觀察到少數(shù)可用藥物控制的不良反應(yīng)（癲癇和多動）。該研究表明細(xì)胞治療具有協(xié)同效應(yīng)，還可能平衡大腦的新陳代謝。2019年，RIORDAN等［26］的一份研究調(diào)查了對ASD患兒使用同種異體UCMSC的安全性和有效性，20例（6～16歲）自閉癥患者每12周接受1次干細(xì)胞靜脈移植（與治療前進(jìn)行自身對照），隨訪1年，在治療最后1次后3個月和12個月進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)治療過程中，與治療有關(guān)的不良事件（頭痛、發(fā)燒和疲勞）為輕度或中度，持續(xù)時間短，而且8例受試者的CARS和自閉癥治療評估清單（ATEC）得分下降，其中5例受試者血清炎癥細(xì)胞因子水平降低。2020年的一項研究評估了使用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs）鞘內(nèi)注射治療ASD的安全性及有效性，通過將32例（5～15歲）患者隨機(jī)分為治療組和對照組，治療組患者在4周時間內(nèi)鞘內(nèi)注射2次BMMSCs，之后并未發(fā)現(xiàn)與注射相關(guān)的副作用，但并未達(dá)到預(yù)期的治療效果（僅CGI結(jié)果有微小的改善），該研究認(rèn)為，盡管自體BMMSCs的使用是安全的，但考慮到昂貴、復(fù)雜的制備和注射過程及其微弱的療效，其性價比并不理想［27］。同時，現(xiàn)有的MSCs治療自閉癥的臨床試驗還較少，因此，不同MSCs治療ASD的安全性及有效性仍需進(jìn)一步研究。

5 不足與缺陷

5.1 受試者數(shù)量相對較少 現(xiàn)有的臨床試驗使用的樣本量較少，以上案例多是基于少量受試者，50例受試者以上的相關(guān)研究極少，這或許是由于參與者自身或家庭因素以及對研究內(nèi)容不了解導(dǎo)致對最后結(jié)果的擔(dān)憂，使參加研究的人數(shù)較少，臨床研究樣本不足會對結(jié)果的可靠性造成一定影響［24］。

5.2 隨訪時間 盡管上述臨床試驗總體上報告了ASD患者進(jìn)行MSCs移植治療的安全性，但現(xiàn)有的關(guān)于該研究的隨訪時間大多只有治療后的12個月，目前暫無長期影響的數(shù)據(jù)，但自閉癥的治療效果需要更長的時間觀察［3］。

5.3 療效評定 ASD的療效評定方法應(yīng)通過國際認(rèn)可、標(biāo)準(zhǔn)化，需要統(tǒng)一的量表進(jìn)行評估，目前雖有美國出版的《精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊》被用作自閉癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但干擾因素多，無法正確且穩(wěn)定地評估。使用MSCs治療自閉癥就可以對炎癥標(biāo)志物進(jìn)行檢測，先進(jìn)的成像研究也可以更好地了解MSCs對ASD患者的生物學(xué)影響。盡管如此，因自閉癥的病情受生活環(huán)境和家庭因素差異的影響也較大，MSCs的后續(xù)治療效果也許會因此混淆。

5.4 細(xì)胞來源 現(xiàn)有的臨床研究中用于治療ASD的MSCs類型很多，如UCMSCs、同種異體UCMSCs、BMMSCs等，研究都證實了這種治療方法的安全性，但其療效并未得到統(tǒng)一的結(jié)果，因此需要進(jìn)一步研究可能有效的MSCs。現(xiàn)已知ASD有遺傳異質(zhì)性，因此ASD受試者體內(nèi)會存在某些遺傳修飾，所有細(xì)胞類型都保留這些改變。因此可以嘗試同種異體移植，但需要考慮捐助者的細(xì)胞獲得性和有可能的傳染病測試［26-27］。

5.5 給藥途徑及頻率 上文臨床研究中有靜脈移植和鞘內(nèi)注射，動物研究還使用過鼻內(nèi)給藥。靜脈給藥屬于全身給藥，無吸收過程且起效快；鞘內(nèi)注射屬于局部給藥，較靜脈注射更有針對性，可克服血-腦脊液屏障，使細(xì)胞隨腦脊液循環(huán)自然到達(dá)蛛網(wǎng)膜下腔，從而彌散在整個腦室系統(tǒng)，而不會造成任何神經(jīng)損傷；動物實驗的鼻內(nèi)給藥途徑可增加藥物的腦內(nèi)遞送，且鼻黏膜對抗原具有一定敏感性，但由于低滲透性和較高的代謝降解，因此對生物大分子的遞送有限制性，且有研究表示長期鼻內(nèi)給藥可能導(dǎo)致鼻黏膜完整性喪失。目前關(guān)于MSCs治療ASD的給藥途徑并無統(tǒng)一意見，且給藥頻率和劑量也沒有標(biāo)準(zhǔn)。這些都會影響患者配合度和治療效果，以致研究結(jié)果存在差異。

6 展望

盡管現(xiàn)有的研究都肯定了MSCs治療ASD的安全性和有效性，顯示出其潛在研究價值，但要想證明MSCs治療ASD的療效，還須對MSCs的作用機(jī)制進(jìn)行更加深入、全面、詳盡的研究和大規(guī)模臨床試驗，以確定給藥后的組織分布、長期安全有效性及最佳干預(yù)年齡，從而更好地了解MSCs對自閉癥的治療效果及其機(jī)制［28］。