韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌的化感作用

謝一琪 牛玉 劉子記 于仁波 韓旭

摘 ?要：為探究韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌的化感作用，本研究以‘山東雪韭6號’韭菜和苦瓜枯萎病菌為試驗材料，水培法收集韭菜根系分泌物，采用菌絲生長速率和孢子萌發法研究韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌的化感作用;利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）鑒定根系分泌物組成成分，篩選可能的主效化感物質，進一步通過體外抑菌試驗驗證其化感作用，明確主效化感物質。結果表明，隨著韭菜根系分泌物濃度的升高，苦瓜枯萎病菌的菌落直徑和孢子萌發數均呈先降后升的趨勢，當分泌物濃度為3.22 mg/mL時，抑制作用最大，滿足化感作用低濃度促進、高濃度抑制的特性。通過GC-MS鑒定出韭菜根系分泌物中的主要成分為酚類、酯類、烷烴類、醇類、烯類、芳香類，可能的化感物質為鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）。通過體外抑菌試驗證實這3種物質對苦瓜枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發都有不同程度的化感抑制作用，且抑菌效果為2，4-二叔丁基苯酚>鄰苯二甲酸二丁酯>2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），明確其為化感物質。由此可知，韭菜根系分泌的主效化感物質對苦瓜枯萎病菌有顯著的化感抑制作用，這為苦瓜間套輪作韭菜防控苦瓜枯萎病和研制植物源抑菌劑提供了理論依據和技術支撐。

關鍵詞：韭菜根系分泌物;苦瓜枯萎病;尖孢鐮刀菌;化感作用;化感物質

中圖分類號：S642.5 ? ? ?文獻標識碼：A

Allelopathy of Chinese Chives Root Exudates on Fusarium Wilt of Bitter Gourd

XIE Yiqi1，2， NIU Yu2， LIU Ziji2， YU Renbo2， HAN Xu2*

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Fusarium wilt of bitter gourd is a soil-borne disease caused by Fusarium oxysporum f. sp. momodicae， which seriously harms the yield and quality of bitter gourd. In traditional production， chemical pesticides mostly used to prevent and control Fusarium wilt of bitter gourd， but there are potential risks of environmental pollution and ecological damage. Although the method of grafting and replacing roots is also used in the production to control Fusarium wilt of bitter gourd， lack of high-resistance rootstock resources and high production costs have led to poor control effects and difficult to achieve. Therefore， there is an urgent need for an eco-environmental， green and effective method to prevent and control Fusarium wilt of bitter gourd. The cultivation patterns of intercropping relay intercropping and crop rotation are one of the effective methods to reduce soil-borne diseases. Bulb vegetable （Allium）， such as garlic， green garlic， and onions， are recognized as good previous crops， and the root exudates can effectively reduce the occurrence of soil-borne diseases by improving the soil micro-ecological environment， thereby alleviating continuous cropping obstacles. Studies have shown that the volatile and extract components of Chinese chives have the potential to resist fungal diseases. However， there are few studies on the Chinese chive root exudates， especially the allelopathy of Chinese chive root exudates on regulating resistance to Fusarium wilt of bitter gourd has not been reported. In order to explore the allelopathy of Chinese chive root exudates on Fusarium oxysporum f. sp. momdicae， the study used Chinese chive variety ‘Shandong Xuejiu No. 6’ and Fusarium oxysporum f. sp. momdicae as test materials， and Chinese chive root exudates were collected by hydroponics. The methods of mycelia growth rate and spore germination were used to study the allelopathy of Chinese chive root exudates on Fusarium oxysporum f. sp. momodicae. The components of root exudates were identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. According to the identification results of GC-MS， the possible main allelochemicals of root exudates were screened， and the allelopathy were further verified by in vitro antifungal test， then the main antifungal allelochemicals were clarified. With the increase of the concentration of Chinese chive root exudates， both the colony diameter and the number of spore germinations showed a trend of decreasing first and then increasing. When the concentration of Chinese chive root exudates was 3.22 mg/mL， the maximum inhibitory effect was achieved， the mycelia growth inhibition rate was 21.6%， and the spore germination inhibition rate was as high as 36.8%. This result satisfies the characteristics of the allelopathy which could promote antifungal effect at low concentration and inhibit antifungal effect at high concentration. The results of GC-MS indicated that the main components of Chinese chive root exudates were identified as phenols， esters， alkanes， alcohols， alkenes， and aromatics. According to the results of GC-MS identification and previous studies， the possible allelochemicals were dibutyl phthalate， 2，4-di-tert-butylphenol， 2，2-methylenebis-（4-methyl 6-tert-butylphenol）. The in vitro antifungal test confirmed that the three substances had varying degrees of allelopathic inhibition effects on the mycelia growth and spore germination of F. oxysporum f. sp. momodicae， and its antifungal effect was determined to be 2，4-di-tert-butylphenol>dibutyl phthalate> 2，2-methylenebis-（4-methyl-6-tert-butyl phenol）. Among them， the inhibitory effect of 2，4-di-tert-butylphenol on the mycelia growth and spore germination of Fusarium oxysporum f. sp. momdicae increased with the increase of concentration. The effect of dibutyl phthalate and 2，2-methylenebis-（4-methyl-6-tert-butylphenol） at different concentrations on the mycelia growth and spore germination of F. oxysporum f. sp. momdicae showed the allelopathic effect of promoting at low concentration and inhibiting at high concentration. 2，4-Di-tert-butylphenol had the best antifungal activity among them. When its concentration was 0.1 mmol/L， the inhibition rate of colony diameter reached 82.93%， and the inhibition rate of spore germination reached 77.59%. Both dibutyl phthalate and 2，2-methylenebis-（4-methyl-6-tert- butylphenol） reached the highest allelopathic inhibitory effect on F. oxysporum f. sp. momodicae at a concentration of 0.5 mmol/L. It can be seen that the main effect allelochemicals exudated by Chinese chive roots have a significant allelopathic inhibitory effect on F. oxysporum f. sp. momdicae. It is expected to provide theoretical basis and technology support for the study of prevention and control of Fusarium wilt of bitter gourd by using Chinese chives intercropping， relay intercropping and rotation with bitter gourd and development of plant-derived antifungal agents.

Keywords： Chinese chive root exudates; Fusarium wilt of bitter gourd; Fusarium oxysporum f. sp. momdicae; allelopathy; allelochemicals

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.022

苦瓜（Momordica charantia L.）屬葫蘆科苦瓜屬一年蔓生草本植物，又名涼瓜，起源于東印度，現熱帶、亞熱帶和溫帶區域為主栽地區，加勒比海和南美地區也有栽培[1]。與一些常見的蔬菜相比，苦瓜的營養成分含量更高，富含多種維生素、礦物質及纖維素[2-3]。苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. momodicae）引起的一種嚴重危害苦瓜產量和品質的土傳病害[4]，任何時期均可發病，嚴重時導致整株死亡[5]。傳統生產上多采用化學農藥防治苦瓜枯萎病的發生，但普遍存在污染環境和破壞生態的潛在風險;雖然生產中也選用嫁接換根的方式防治苦瓜枯萎病，但高抗砧木資源的匱乏和較高的生產成本導致防效欠佳且難以實現。因此急需一種生態環保、綠色有效的方法來防控苦瓜枯萎病的發生。

化感作用這一概念是由奧地利科學家MOLISCH在1937年首次提出，主要是指植物之間相互作用的化學關系[6]。現被定義為一種植物通過向環境釋放化感物質而對另外一種植物（或微生物）所產生的直接或間接的有害或有益的作用[7]。化感作用是植物通過向環境釋放化感物質而實現的，化感物質主要通過雨霧淋溶、自然揮發、根系分泌、植株分解4種途徑釋放到環境中。植物根系分泌的化感物質對防治土壤線蟲、土傳真菌病害都具有重要作用[8-9]。間套輪作模式是減輕土傳病害的有效方法之一，寄主植物的根系分泌物能夠刺激尖孢鐮刀菌孢子萌發，因此與非寄主植物輪作能夠抑制寄主植物枯萎病的發生[5]。蔥蒜類作物是良好的前茬作物，也是公認的化感作物，已廣泛應用到間套輪作的栽培模式中。大蒜、蒜苗、洋蔥等蔥蒜類蔬菜作物的根系分泌物通過改善土壤微生態環境，能夠有效減少土傳病害的發生，從而緩解連作障礙[10-12]。

植物源殺菌劑對環境和人類健康的危害較小，長期以來被認為是化學殺菌劑的理想替代品。韭菜（Allium tuberosum L.）也是主要的蔥蒜類蔬菜作物。韭菜提取物對多種植物致病菌的生長均有顯著的抑制作用，如甘藍枯萎病菌[13]、香蕉枯萎病菌[14]、蘋果輪紋病菌[15]、棉花黃萎病菌[16]、柑橘青霉病菌[17]、芒果蒂腐病菌[18]等。韭菜提取物通過影響孢子營養物質的代謝來抑制番茄尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici）孢子的萌發[19]。香蕉和辣椒與韭菜間作可以有效控制香蕉枯萎病和辣椒疫病的發生，實現生態防控[20-21]。關于韭菜根系分泌物化感作用的研究較少，特別是研究韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌的化感作用尚未見報道。

本研究采用水培法收集韭菜根系分泌物，通過菌絲生長速率和孢子萌發法研究韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌的化感作用，采用氣相質譜-色譜聯用技術（GC-MS）鑒定化合物組成成分，根據鑒定結果篩選韭菜根系分泌物中可能的有效化感物質，進一步通過菌絲生長速率法和孢子萌發法驗證其對苦瓜枯萎病菌的化感作用，明確主效化感物質，以期為利用韭菜間套作苦瓜誘導枯萎病抗性的研究和研制植物源抑菌劑提供理論依據和技術支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

韭菜品種：‘山東雪韭6號’。

供試病原菌：苦瓜枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. momodicae），由廣西農業科學院蔬菜研究所陳振東研究員提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?韭菜根系分泌物的收集 ?參考韓旭等[22]的方法，略有改動。用蒸餾水洗凈韭菜根系，盡量保證不傷根系，置于水培裝置中;將配制好的Hoagland營養液注入水培裝置，用量以剛好沒過韭菜整個根部為宜，每5 d收集一次根系分泌物，并更換新的營養液，共收集6次并混勻;最后一次收集根系分泌物后用蒸餾水沖洗韭菜根系，去除營養液殘留，用濾紙拭干其表面多余水分并稱重。將已收集的根系分泌物通過0.45 μm的水系微孔濾膜抽濾，再減壓濃縮到0.5 g/mL（以韭菜鮮根重量計算），即為根系分泌物的母液，4℃保存備用。

1.2.2 ?苦瓜枯萎病菌菌落直徑的測定 ?采用菌絲生長速率法[23]測定菌落直徑。待PDA培養基冷卻，將根系分泌物按不同比例加入PDA培養基中，配制終濃度為0 mg/mL（CK）、1.76 mg/mL（T1）、3.22 mg/mL（T2）、4.46 mg/mL（T3）、5.52 mg/mL（T4）的平板;用直徑為7 mm的滅菌打孔器在供試苦瓜枯萎病病原菌菌落邊緣打制大小一致的菌餅，將其接種在含有根系分泌物的各平板中央，每皿1個菌餅，每個處理3次重復，26℃恒溫培養7 d，采用十字交叉法測量菌落直徑（cm），計算菌絲生長抑制率（%）。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.2.3 ?苦瓜枯萎病菌孢子萌發的測定 ?采用田丹丹等[24]等方法測定孢子萌發率。將供試苦瓜枯萎病病原菌接種在PDB培養基中，120 r/min、26℃振蕩培養7 d，四層無菌紗布過濾，用無菌水將孢子懸浮液稀釋至103 CFU/mL。配制不同濃度PDA培養基（同1.2.2），取100 μL配制好的孢子懸浮液加至平板中，用涂布棒均勻涂抹，26℃恒溫培養3 d，統計每個處理的孢子萌發個數，每個處理3次重復，計算孢子萌發抑制率（%）。

孢子萌發抑制率=（對照孢子萌發數-處理孢子萌發數）/對照孢子萌發數×100%

1.2.4 ?韭菜根系分泌物分離及GC-MS鑒定 ?采用萃取法[25]對韭菜根系分泌物進行分離。取根系分泌物母液200 mL，按溶液極性依次用石油醚、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷5種有機溶劑按體積比1∶1的比例萃取后，將上述各組分分別經旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，溶于5 mL色譜純甲醇中，用于GC-MS鑒定。

采用GC-MS鑒定（Agilent 7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀）韭菜根系分泌物的化合物組成。色譜條件：DB-5石英毛細管柱（30 m× 0.25 mm，膜厚度0.25 μm）;載氣He，流速1.0 mL/min;進樣口溫度250℃;程序升溫：柱溫50℃（保持2 min），以6℃/min程序升溫至250℃（保持15 min）。質譜條件：離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;EI源（電子轟擊源），轟擊電壓70 eV;掃描范圍m/z 30～600 amu;1 μL進樣，不分流，溶劑延遲時間為2.8 min。根據數據庫比對結果，選擇相似度≥70%的化合物作為根系分泌物中可能的有效化感物質。

1.2.5 ?韭菜根系分泌物主效化感物質的驗證 ?根據GC-MS鑒定結果，篩選韭菜根系分泌物可能的有效化感物質為鄰苯二甲酸二丁酯（A）、2，4-二叔丁基苯酚（B）、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯）（C）。將A溶于色譜純甲醇溶液中，配制成5、10、50、100 mmol/L母液，按1∶100的比例添加到已滅菌的PDA培養基中制成終濃度為0.05 mmol/L（A1）、0.1 mmol/L（A2）、0.5 mmol/L（A3）、1.0 mmol/L（A4）的平板待用;將B配制成0.5、1、5、10 mmol/L母液，同樣按1∶100的比例制成終濃度0.005 mmol/L（B1）、0.01 mmol/L（B2）、0.05 mmol/L（B3）、0.1 mmol/L（B4）的平板備用;將C溶于色譜純甲醇溶液中，配制成5、10、50、100 mmol/L母液，按1∶100的比例添加到已滅菌的PDA培養基中制成終濃度為0.05 mmol/L（C1）、0.1 mmol/L（C2）、0.5 mmol/L（C3）、1.0 mmol/L（C4）的平板待用。3種化感物質的驗證均以含有1%色譜純甲醇的PDA培養基為對照（CK）。接種菌餅和涂布方法同1.2.3和1.2.4。

1. 3 ?數據處理

使用Excel 2010軟件對試驗數據進行統計分析，使用SPSS 22.0軟件進行顯著性檢驗。

2 ?結果與分析

2.1 ?不同濃度韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌的化感作用

2.1.1 ?對菌絲生長的影響 ?由圖1可以看出，隨著根系分泌物濃度的增加，菌落直徑呈現先降后升的趨勢，T2處理達到最小值。培養7 d時，CK的菌落直徑為7.3 cm，T1、T2、T3、T4處理的菌落直徑分別為6.2、5.8、6.4、6.7 cm，均顯著低于CK（P<0.05），菌絲生長抑制率分別為15.45%、21.6%、12.4%、8.64%。表明韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌菌絲生長有明顯的抑制作用，低濃度的根系分泌物抑制作用較強，隨著濃度增加，抑制作用反而降低。

2.1.2 ?對孢子萌發的影響 ?隨著韭菜根系分泌物濃度逐漸升高，孢子萌發數量呈現先下降后上升的變化趨勢（圖2）。培養3 d后，CK孢子萌發個數達到146個，T1、T2、T3、T4處理的孢子萌發個數分別為126、92、95、119個，且各濃度處理均顯著低于對照（P<0.05），孢子萌發抑制率分別為13.50%、36.84%、35.01%、18.54%。T2處理孢子萌發數量最低，抑制率達最高（36.8%）。表明韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌孢子萌發有明顯的抑制作用，并表現為低濃度抑制作用強，高濃度反而弱。

2.2 ? 韭菜根系分泌物不同組分的化感物質GC-MS鑒定

2.2.1 ? 石油醚組分鑒定結果 ?石油醚組分共檢測出113個化合物，相似度≥70%的化合物有7個（表1），分別為苯基甲氧基肟、十二烷、2，4-二叔丁基苯酚、3-十二烷基-2，5-呋喃二酮、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、異戌酸乙酯、γ-谷甾醇。此組分中可能的有效化感物質為2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），相似度分別為80.63%和87.77%。

2.2.2 ?正己烷組分鑒定結果 ?正己烷組分共檢測出133個化合物，相似度≥70%的化合物有7個（表2），分別為正辛烷、六甲基環三硅氧烷、對二甲苯、正十二烷、3，5-二叔丁基苯酚、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、鄰苯二甲酸二辛酯。此組分中可能的有效化感物質為2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），相似度為91.99%。

2.2.3 ?乙醚組分鑒定結果 ?乙醚組分共檢測出189個化合物，相似度≥70%的化合物有23個（表3）。其中烷烴類包括2-乙氧基-3-氯丁烷、正十二烷;酯類包括鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸-1-丁酯-2-異丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯;醇類包括1，2-丁二醇、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、叔十六硫醇;酚類有3，5-二叔丁基苯酚;醛類有甘油縮甲醛，烯類包括（+）-長葉環烯、異長葉烯、長葉烯，醚類有辛基縮水甘油醚。乙醚組分中可能的有效化感物質有鄰苯二甲酸二丁酯，相似度為91.93%

2.2.4 ?乙酸乙酯組分鑒定結果 ?乙酸乙酯組分共檢測出160個化合物，相似度≥70%的化合物有4個（表4），分別為3-羥基-2-丁酮、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、3，5-二叔丁基苯酚、2，4-二叔丁基苯酚。此組分中可能的有效化感物質為2，4-二叔丁基苯酚，相似度為76.92%。

2.2.5 ?三氯甲烷組分鑒定結果 ?三氯甲烷組分共檢測出129個化合物，相似度≥70%的化合物有4個（表5），分別為（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、間二甲苯、2，4-二叔丁基苯酚、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）。此組分中可能的有效化感物質為2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），相似度分別為78.69%和74.24%。

2.3 ? 韭菜根系分泌物主效化感物質的驗證

根據GC-MS鑒定結果和前人研究結果[26-28]確定鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）為韭菜根系分泌物的主效化感物質，并對其進行驗證。3種主效化感物質對苦瓜枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發均有不同程度的抑制作用。

2.3.1 ?鄰苯二甲酸二丁酯對苦瓜枯萎病菌的化感作用 ?由表6可知，隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的升高，苦瓜枯萎病菌菌落直徑和孢子萌發數整體呈先下降后上升的趨勢，且A3（0.5 mmol/L）處理的抑制作用最大，菌落直徑最小，孢子萌發個數最少，此時抑菌率為33.25%，孢子萌發抑制率為43.18%，且顯著低于對照（P<0.05），其余各濃度處理對菌絲生長和孢子萌發的抑制作用也均達顯著水平（P<0.05）。

2.3.2 ?2，4-二叔丁基苯酚對苦瓜枯萎病菌的化感作用 ?隨著2，4-二叔丁基苯酚濃度增加，對苦瓜枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發抑制作用越來越強，各處理菌落直徑和孢子萌發數逐漸降低。即CK>B1>B2>B3>B4，除B1（0.005 mmol/L）處理外，其他各處理均顯著低于對照（P<0.05），B4（0.1 mmol/L）處理對菌絲生長的抑制率最高，達82.93%，對孢子萌發抑制率也達最高，為77.59%（表7）。

2.3.3 ?2，2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）對苦瓜枯萎病菌的化感作用 ?隨著2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）濃度的升高，菌落直徑先減后增，各處理均顯著低于對照（P<0.05），且在C3（0.5 mmol/L）處理時菌落直徑達到最小，此時菌落直徑為4.2 cm，抑菌率達到30.96%。C3（0.5 mmol/L）處理的孢子萌發數顯著低于對照（P<0.05），孢子萌發抑制率達21.48%，其他各處理孢子萌發數雖均低于對照，但無顯著差異（P>0.05）（表8）。

3 ?討論

植物在生長過程中常常受到病原微生物，尤其是病原真菌的危害。近年來，植物根系分泌物在防治真菌病害上深受關注。植物根系是各種土傳病害的發生場所。面對病原菌的侵染，植物通過根系分泌的化感物質抑制病原菌，進行化學防御。

韭菜揮發物和提取物對植物病害的調控具有十分重要的作用，如韭菜揮發物和浸提液均能抑制香蕉枯萎病菌的生長[29]。香蕉與韭菜間作能夠降低香蕉枯萎病的發病率[30-31]，韭菜提取液處理蘋果枝條和果實能夠抑制蘋果輪紋病的發生[15]。姚琴等[32]研究發現水培韭菜根系分泌物對棉花大麗輪枝菌菌絲生長和孢子萌發均表現出顯著的抑制作用。在本研究中，水培韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌的菌絲生長和孢子萌發菌具有顯著的化感抑制作用。本研究結果與姚琴等的研究結果類似，均證明水培韭菜根系分泌物對植物致病菌具有抑制作用。韭菜和大蒜同屬于蔥蒜類作物，已有研究證實大蒜根系分泌物對黃瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌均有顯著的化感作用[33]，因此韭菜根系分泌物對蔬菜作物致病菌同樣應該具有化感作用，本研究發現韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病致病菌具有顯著的抑制作用，且隨著濃度的升高，抑制作用表現為先升高后降低的趨勢，滿足化感作用低濃度促進，高濃度抑制的作用規律，由此證實了韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌具有顯著的化感作用，本研究結果與其一致。廉法卓等[29]采用菌絲生長速率法和孢子萌發法研究發現，韭菜浸提液可抑制香蕉枯萎病菌的生長，雖然本研究選用的是韭菜根系分泌物和苦瓜枯萎病菌為研究對象，但是研究結果也與其相同。前人研究發現，大蔥根系分泌物對黃瓜枯萎病病原菌菌絲生長和孢子萌發的抑制作用隨著分泌物濃度的升高而逐漸增強[34]，本研究抑制作用規律與其不一致，可能是因為不同植物根系分泌物主效化感物質的種類與含量存在差異，導致對致病菌的抑制作用規律也不同，但一致的是，二者均對枯萎病致病菌有明顯的抑制作用。

RICE[7]將化感物質分為15類，分別為簡單的水溶性有機酸、直鏈醇、脂肪醇、脂肪族醛和酮;簡單的不飽和內酯;長鏈脂肪酸和多炔;醌類;簡單的酚、苯甲酸及其衍生物;肉桂酸及其行生物;香豆素類;黃酮類;單寧;萜類和甾族化合物;氨基酸和多肽;生物堿和氰醇;糖苷硫氰酸酯;嘌呤和核酸和。本研究通過對韭菜根系分泌物的GC-MS鑒定分析表明，其主要成分為酚類、酯類、烷烴類、醇類、烯類、芳香族，均屬于化感物質范疇。吳曉婷等[35]通過GC-MS鑒定水培收集的大蒜根系分泌物，主要成分只有酚類和脂類，本研究鑒定結果也包含酚類和酯類，但其他組分不同。李敏等[36]鑒定出大蒜連作土壤中的根系分泌物主要有烷烴類、醇類、酯類、苯類等，本研究鑒定結果與其基本一致。劉素慧[37]鑒定組培大蒜根系分泌物，主要成分有酚類、酸類、酯類和硫化物。周艷麗[38]鑒定水培大蒜主要成分有酚類、酯類、烷烴類、醇類、烯類、芳香族和硫化物。除硫化物外，本研究鑒定結果與前人的基本一致，可能是蔬菜種類、培養分離條件不同等導致蔬菜生理代謝不同，產生的根系分泌物也不同。

根據GC-MS鑒定和前人研究結果，篩選確定韭菜根系分泌物可能的主效化感物質為2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）。鄰苯二甲酸二丁酯已被證實為大豆、辣椒和馬鈴薯根系分泌物中的主效化感物質[39-41]，2，4-二叔丁基苯酚被證實為蘭州百合根系分泌物中的化感物質[42]。2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）廣泛存在于多種植物的根系分泌物中，例如大蒜[43]、核桃[44]、大蔥[45]、蘭州百合[46]。因此，本研究將進一步驗證這3種化感物質對苦瓜枯萎病菌的化感作用。

通過驗證2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）對苦瓜枯萎病菌的化感作用，明確其抑菌效果強弱順序為2，4-二叔丁基苯酚>鄰苯二甲酸二丁酯>2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），且隨著2，4-二叔丁基苯酚濃度的增加抑菌效果逐漸增加，不同濃度的鄰苯二甲酸二丁酯和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）對苦瓜枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發表現為低濃度促進，高濃度抑制的化感作用規律。鄰苯二甲酸二丁酯可以有效控制雜草[47]和土傳病害[48-49]，能抑制茄子根際黃萎菌的增殖，有效控制茄子土傳病害黃萎病的發生[48];施用外源鄰苯二甲酸二丁酯能夠有效降低西瓜枯萎病的發病率[49];大蒜根系分泌物的有效化感物質為鄰苯二甲酸二丁酯，分別對煙草枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發具有較強的抑菌作用[26]，本研究結果與以上研究結果一致。2，4-二叔丁基苯酚可以延緩雜草的生長發育[27]、影響幼苗生長發育和光合作用[50-52]。不僅如此，2，4-二叔丁基苯酚對秀麗隱桿線蟲和朱砂葉螨有較好的毒殺作用[53-54]。黃煒[55]研究得出百合根系分泌物中的化感物質2，4-二叔丁基苯酚與致病鐮刀菌對百合枯萎病的發生具有協同作用，0.05～0.2 mmol/L的2，4-二叔丁基苯酚還能夠促進致病鐮刀菌的產孢量，本研究結果與其不一致，本研究證實隨著2，4-二叔丁基苯酚濃度的增加，對苦瓜枯萎病菌的抑制作用不斷增加，0.1 mmol/L處理的孢子萌發抑制率高達77.59%，造成不同結果的原因可能是供試菌種不同導致達到抑菌作用的濃度不同。已有研究表明2，2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）是野生果實刺梨（Rosa roxburghii）揮發油中的主要成分，對4株多藥耐藥金黃色葡萄球菌均有抑菌活性，并具有抗腫瘤的功效[28， 56]，但其在對植物病害的抑制作用方面尚未見報道。本研究證實2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）對苦瓜枯萎病菌具有一定的化感抑制作用，且滿足低濃度促進，高濃度抑制的化感作用規律，可將其研發成植物源殺菌劑防治苦瓜枯萎病。

本研究證實在體外抑菌試驗中，韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌有較強的化感抑制作用，為生產上利用間套輪作韭菜以防控苦瓜枯萎病奠定基礎和提供技術支撐。通過主效化感物質驗證試驗得出韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌的抑制作用與鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）3種物質有關，為研制植物源殺菌劑防控苦瓜枯萎病提供理論依據，但關于韭菜根系分泌物調控苦瓜枯萎病致病菌的分子機制和化感作用機理還需要進一步的研究。

4 ?結論

本研究通過體外抑菌試驗證實，水培收集的韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌具有化感作用;通過GC-MS鑒定分析，明確鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）可能是導致韭菜根系分泌物對苦瓜枯萎病菌化感抑制作用的主效化感物質，進一步選用這3種物質的外源化學品驗證了其對枯萎病菌的化感抑制作用，進而明確了這3種物質均為韭菜根系分泌物發揮化感作用調控苦瓜枯萎病菌的主效化感物質。

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