微生物降解秸稈的研究進展

王仁耀，王娟，李德茂，王乃可，才金玲

(1.天津科技大學 化工與材料學院，天津 300457；2.中國科學院 天津工業生物技術研究所 天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津 300308)

中國是世界上農作物秸稈產量最大的國家，秸稈資源量達到全球總量的五分之一[1]。秸稈的處理通常有三種方式：直接田間焚燒、農業化利用、工業化利用。其中，直接田間焚燒會造成大氣污染和資源浪費等一系列問題。秸稈的農業化利用目前以還田為主，通過復合菌群加速秸稈腐解，為作物提供養分。工業化利用通過微生物或者水解酶等處理秸稈生產乙醇、沼氣、丁酸等。然而，酶解工藝成本過高、條件苛刻，并且效率較低。高效秸稈降解復合菌群具有低成本、高效、降解條件寬泛的特點，對秸稈變廢為寶具有重要的意義。

秸稈的農業化和工業化利用都離不開秸稈的降解，而微生物是秸稈降解的關鍵所在。早期，國內外學者針對秸稈降解的研究更多的體現在篩選單菌株后構建復合菌系，在實驗室條件下篩選出具有較高纖維素酶活和半纖維素酶活的單個菌株，然后將菌株進行復配構建復合菌系，繼而對復合菌系進行條件優化來達到降解秸稈的目的。但是，目前的研究表明秸稈的降解是不同菌種協同作用的結果，并且在實驗室條件下不可培養的微生物在秸稈降解中起到一定的作用[2]。另外，構建的復合菌系容易受到外源微生物的影響，不太符合秸稈還田的實際應用場景。因而，采用限制性培養方法馴化微生物獲得一組高效秸稈降解菌群，對農作物秸稈的循環利用和實現可持續發展農業都具有重要的意義。

1 秸稈的降解機理

秸稈中的纖維素、半纖維素和木質素等組分統稱為木質纖維素，在一系列降解酶協同作用下，各組分基質分子內的化學鍵被依次破壞，致使結構裂解[3]。

纖維素是構成纖維細胞骨架的主要物質，是由葡萄糖分子單體之間通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的一種線性長鏈結構[4]。纖維素酶復合酶系由外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和β糖苷酶組成[5]，將纖維素降解為纖維二糖和葡萄糖等小分子還原物質。

半纖維素聚合度較低，呈現非結晶態，主要作為填充物質分布在纖維素大分子之間[4]。木聚糖是組成半纖維素結構框架的最小單體，串聯方式為β-1,4糖苷鍵的相互締合。木聚糖需要多種酶共同參與降解，首先，木聚糖骨架由于內切 1,4-β-D 木聚糖酶隨機切斷導致聚合度降低，然后形成的產物木寡糖和木二糖被外切酶β-木糖苷酶分解為木糖。

木質素本質上是由苯丙烷單體聚合而成，并且由大量醚鍵連接而成的三維網狀結構的芳香族物質。木質素的降解以功能酶為主，同時需要多種酶的協同作用，在催化作用下產生不穩定的中間體，繼而自發一系列降解反應，生成小分子物質[6]。

另外，纖維素多酶復合體是最近發現的一種主要存在于厭氧微生物中的類似于核糖體的一種細胞器，具有高效的木質纖維素降解能力。其由纖維素酶和腳手架蛋白構成，腳手架蛋白有吸附木質素的纖維素結合域和專一性結合纖維素酶的粘附結構域，從而使纖維素酶在物理空間上聚集[7]。相比于纖維素酶的簡單混合，人工體外設計構建的多酶復合體的降解效率可以提高6倍[8]。

2 降解秸稈的微生物

自然環境中存在著大量的木質纖維素降解菌，主要通過篩選高效純培養菌株、人工構建復配菌系和采用限制性培養法馴化復合菌群的方法進行研究。另外，隨著基因工程技術的快速發展，導入外源基因，構建工程菌株也受到越來越多的關注與研究[9]。

2.1 降解秸稈的純菌

自然界中存在著大量可以利用秸稈的微生物，從環境中篩選高效菌株是早期的研究方式。純培養菌株的篩選一般先對來源于沼液、動物糞便及土壤等環境中的微生物進行培養，而后以秸稈降解相關的酶活力大小為降解能力指標進行復篩得到[10]。目前，細菌、真菌和放線菌等都對木質纖維素表現出一定的降解能力。

細菌中多個菌屬都可以降解纖維素和半纖維素，但其降解木質素的報道很少。研究表明細菌在木質素降解中起輔助作用，可以使木質素結構發生改性，但無法使其礦化[11]。細菌生長快、抗逆性強、耐酸堿的特點使其擁有巨大的應用潛力[12]。目前，已被報道的能夠降解木質纖維素的細菌主要有噬纖維菌(Cytophaga)、芽孢桿菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)和醋弧菌(Acetivibrio)等[13]。

真菌在木質纖維素的降解中起到主要作用。真菌纖維素酶活性較高，產生的胞外酶種類更為齊全，但是真菌的生長及產酶環境的敏感性限制了其大規模的開發利用。絲狀真菌的菌絲可以穿透木質素形成的屏障，由內而外進行木質纖維素的降解。曲霉(Aspergillus)、木霉(Phanerochaete)、絲狀真菌(Trichoderma)和白腐真菌(Phanerochaete)等菌屬受到的關注最多[14]。

在木質纖維素的降解中，放線菌相比于大部分細菌有更高的酶活；相比于真菌，其抵御極端環境能力更強。研究報道有效降解木質纖維素的放線菌主要有鏈霉菌屬(Streptomyces)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、小單孢屬(Micromonospora)和諾卡氏菌屬(Nocardia)等[15]。

利用基因工程重組技術構建高效的基因工程菌，因可實現秸稈的高效降解而受到了越來越多的關注和研究。研究人員將嗜熱梭菌的雙功能纖維素-木聚糖酶基因和梭狀芽孢桿菌的β-葡萄糖苷酶基因重組于畢赤酵母，構建的基因工程菌對于秸稈的降解性能優于兩株單菌的單獨和復配降解[9]。研究表明利用基因工程技術，以枯草芽孢桿菌作為宿主構建高效表達纖維素多酶復合體的工程菌株，可以實現燕麥干青草的高效降解[16]。

2.2 降解秸稈的菌群

在自然環境下，復合菌群的秸稈降解能力大多優于單菌株。菌群生態適應性強，生理代謝功能豐富，其菌群內部微生物間協同作用是木質纖維素降解的關鍵所在。目前，復合菌群構建主要有高效單菌株復配和限制性培養法馴化兩種方式。

單菌株復配構建菌群周期較短，從環境中篩選出木質纖維素降解單菌進行拮抗性實驗，選取無拮抗作用的菌株進行復配，然后對其降解條件優化而獲得秸稈降解菌群。李春黎等[17]通過平板初篩和酶活復篩的方式得到的6個菌株復配后，表現出對于煙草秸稈的高效降解，驗證了多功能菌株通過協同作用可以顯著提高生物質秸稈的降解。但是單菌株復配的方式忽略了不可培養菌在菌群中的作用，大量關于菌群的宏基因組分析表明，不可培養菌對菌群的降解能力影響重大[2]。除此之外，在利用單菌株復配構建復合菌群中，各菌株之間的協同和拮抗作用、各菌株混合比例以及互生和共生菌株的篩選分離仍需要深入研究探索。

利用限制性培養法對菌群進行定向馴化是篩選高效菌群的有效方式，通過對堆肥、瘤胃、厭氧沼液和土壤等環境中的菌群進行限制性培養(主要選取溫度和碳源作為限制性條件)，不斷提高秸稈降解率而得到一組高效木質纖維素降解菌群。華彬彬等[18]分別在滅菌秸稈和未滅菌秸稈中加入馴化的菌群MC1進行厭氧發酵，5 d后DGGE和PCR圖譜表明，所得到的秸稈降解菌群符合秸稈在自然條件下的腐解規律，降解率高，環境適應性強，所含物種豐富，限制性培養方法是構建高效秸稈降解菌群的有效手段。

2.3 影響微生物降解秸稈的因素

秸稈預處理和環境因素都會影響微生物降解秸稈的效果。秸稈預處理的主要目的是去除秸稈硅化層和木質素，破壞纖維素定形區結構，降低結晶度[19]。傳統的酸堿預處理方式成本高，污染大，且對水的需求量高，不符合可持續發展的戰略要求。目前常將生物、化學、物理預處理方法結合使用用以打破傳統預處理方法的局限性，獲得較好的秸稈降解效果。因此將各類預處理方法聯合起來作用于水稻秸稈以期打破預處理過程中的局限性勢在必行。

環境因素對微生物降解秸稈的影響主要體現在兩個方面[20]：菌群的物種結構組成與物種演替以及微生物的產酶活性與酶解效率。溫度、pH值、發酵方式、碳氮比(C/N)和金屬離子等均對降解有影響。Liu等[21]研究發現55 ℃條件下菌群對水稻秸稈的降解效果更好，并且微生物的種類沒有發生變化，豐富度有較大的的差異。Wang等[22]研究表明pH會顯著影響與木質纖維素降解有關的酶的活性。Kim等[23]研究發現液態發酵時，靜置狀態利于微生物粘附于秸稈表面而達到更好的降解效果。合適的C/N有助于微生物的生產繁殖，也會影響秸稈降解后腐殖質的質量，初始C/N值在25～35之間被認為是合適的[24]。金屬離子影響微生物的產酶活性和菌群結構，Mn2+和木質素降解酶的活性密切相關[25]，Cu2+可以提高微生物群落對聚合物類碳源的轉化與利用的能力，對水解酶有激活效應[26]。

對降解條件進行優化也是提高微生物降解秸稈能力的重要途徑。在單因素試驗的基礎上，通過響應面的方法對復合菌群的降解條件進行優化也受到了越來越多的關注。泊翠翠[27]通過響應面分析得出溫度和基質含水量是影響固體秸稈基質發酵的關鍵因素，優化之后使纖維素的降解效率提高2.1倍。

3 宏基因組學解析菌群降解秸稈機理

近年來，隨著高通量測序技術的低成本、高質量化發展，宏基因組學技術在微生物群落多樣性和功能研究中得到廣泛利用。微生物多樣性測序能同時對優勢物種、稀有物種以及非培養物種進行分析，精確解析微生物菌群在種、屬水平上的物種組成和豐度情況，是研究微生物菌群多樣性及物種演替變化的重要技術手段[28]。

宏基因組學關注微生物群體種群結構、進化分析、功能基因，解析微生物功能與環境之間的關系，挖掘和研究特定功能基因及代謝通路。Kong等[29]采用宏基因組測序技術，研究了平菇發酵液接種玉米芯進行堆肥過程中微生物菌群的動態變化及代謝功能。結果表明，不同堆肥階段理化性質的變化導致了不同的優勢菌株，不同階段的代謝是由不同的微生物驅動的。Zhong等[30]研究表明不同堆肥階段的關鍵微生物有棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、木犀單胞菌屬和非單胞菌屬，利用共生分析方法確定了堆肥過程中菌群的六個功能模塊。這些模塊與溫度、pH值、有機質降解和堆肥的成熟度顯著相關，宏基因組分析表明，在堆肥過程中，氨基酸、脂肪、能量和異種生物代謝的相對豐度增加。

宏基因組學可以幫助我們發現菌群內部更深層次的機理，對了解微生物之間的協同作用有重要意義。另外，組學分析可以比較菌群在物種組成和功能代謝層面的差異，對于構建高效秸稈降解菌群有重要的指導作用。

4 展望

利用微生物菌群降解秸稈是目前研究的熱點，能夠解決秸稈焚燒導致的環境污染和資源浪費問題。通過宏基因組學技術對微生物菌群進行功能解析，能夠更加深入的探究秸稈的生物降解機理，闡示多種微生物之間的協同作用，提高秸稈分解速度，縮短秸稈分解周期，這對于秸稈的綜合利用至關重要。鑒于此，需要進一步結合宏轉錄組學分析菌群中微生物的代謝聯系，為微生物降解秸稈的實際應用提供更加切實可行的理論依據。