石春梅
(張掖市甘州區林業技術中心推廣站,甘肅 張掖 734000)
枸杞從生物學層面上被劃定為茄科作物,植物所屬為枸杞屬,作為寧夏等地特產,兼具生態、經濟、文化與健康產業等功能,在生長過程中具有突出的抗旱能力、土壤鹽堿耐能力,常以野生形態自然生長在其他作物難以獲取成長所需營養的高鹽堿浸漬土壤環境中,因此也是鞏固河西地區水土以及維護地方綠化成果的關鍵植株品種[1]。隨著科技的不斷創新,枸杞產業在食品、醫藥、保健品等領域吸引了各方學術的目光,枸杞的產量和消費量也呈現較穩定的增長趨勢,枸杞系列產品的應用領域也越來越廣泛,為此該類作物在當下成為了發展河西區域經濟和鄉村振興的重要作物切口。然而在大范圍的非規范性開發過程中,枸杞栽培、植保、加工方面技術支持和普及較為薄弱,并受價格、人工、土地等限制,產業化開發枸杞的步伐明顯受限,這就導致了枸杞在短時間內出現了大范圍生態退化甚至是區域間的銷聲匿跡現象,同時還嚴重影響了同枸杞以伴生形式存在的種種野生植物生長環境。為了解決上述問題,在規避物種變異的前提下使用人工操作扦插育苗繁殖枸杞勢在必行[3]。針對枸杞野生物種所進行的組織培育及繁殖控制,可以在保護原產地野生作物的生態環境穩定的基礎上,推進河西地區開發枸杞產業鏈發展,以商品化及產業化的思路挖掘區域經濟發展貢獻潛力,在解決改善三農問題的同時,鞏固地方脫貧成果。
根據原產地的不同,將產于寧夏、酒泉、張掖的3處代表性西部區域內的枸杞品種作為研究對象[4]。
上述3類差異化枸杞品種實驗對象在試驗中均采用同一種移植的方法被集體種植于張掖市甘州區安陽鄉,自移植以來未發生過大規模病害及影響生存的干旱、風沙脅迫,整體長勢健壯,且共同經歷過花果期。寧夏、酒泉、張掖3種種源在甘肅張掖甘州區的引種表現大致如下:平均枸杞果實實際縱徑約為1.631 cm,平均實際橫徑約為0.765 cm,3種種源果實大小或多或少存在差別,但是差別不顯著,以寧夏地區枸杞果實最大;枸杞果實形狀基本為矩圓形,3種種源果實形狀差異不顯著;枸杞果實顏色較為鮮亮、甜度較高,普遍品質較高。
同時在莖段樣本取樣時,本次試驗將外植體組織樣品的長度嚴格為20~30 cm,同時為避免樣本活性差異,試驗內全部外植體組織樣品均選取自枸杞當年生的莖段及葉片[5]。
2.2.1 基本清潔
選用軟毛刷配合稀釋后的清潔溶液刷洗外植結構表面泥污,而后使用玻璃棒配合80型號吐溫溶液對實驗組織進行深層次清潔,將整體外植組織置于流水下4~6 h后,將實驗體放置于無菌工作臺上,開展正式滅菌作業[6]。
2.2.2 滅菌作業
在控制消殺試劑的品種及濃度的基礎上,設置滅菌時間為變量。在滅菌作業的第一步的75%濃度稀釋酒精滅菌步驟中規定消毒時長為10 s、20 s、30 s 3檔,在步驟結束后使用無菌凈水沖洗試驗組織3~5次[7];在滅菌作業的第二步的0.1%濃度氯化汞溶液殺菌環節中規定消毒時長為1 min、3 min、5 min、7 min、9 min 5檔,在環節結束后使用無菌凈水沖洗試驗對象5~7次;在第三步中技術人員利用無菌潔凈濾紙吸干上述兩步驟中外植體所接觸到的非必要水分,并最終將其置于培養基容器內,以植物組織滅菌培育后的14 d為觀察窗口節點,重點獲取來自不同產地的差異化枸杞種源位于葉與莖區域外植組織的最終成活情況[8]。
在對植物進行組織培養作業時,為保證目標實驗對象的清潔性與純凈度,在正式培育進行前所進行的消殺操作尤為關鍵,該步驟所進行的徹底與否直接影響到后續植物組織培養的質量及病害抵御能力,可以說對枸杞外植結構所進行的滅菌操作直接決定了本次組織培育工作的最終成敗[9]。需要注意的是,不同種原產地的枸杞因其物種基因的差異在消殺環節中的耐受能力各不相同,除此以外,不同的結構取樣部分因其細胞壁結構的組織性差異,其細菌含量的比重也會受到影響,為此,為提升組織培育的成功率,消毒操作必須要針對不同的種源結構與植株取樣位置進行針對性的消毒方案設計[10]。
為找到最優的消殺準備方案,本次實驗在控制消殺試劑的品種及濃度的基礎上,設置滅菌時間為變量。在實驗進程中為包括寧夏、酒泉、張掖在內的3個來自不同產地的枸杞在葉片以及莖段區域的外植區域進行滅菌組織培養準備工作,使目標植物組織以最佳的狀態進入差異化的針對性MS生態培養基內進行后續生長培育,用以獲得來自不同產地種源的枸杞在不同外植區域取樣過程中最為適合的滅菌操作方案[11]。其中在培養過程中為內部未消殺徹底菌群所污染的組織結構同滅菌進程中因耗時過長導致組織死亡的外植結構統一被歸類為試驗中存活失敗的外植組織個體[12]。具體試驗結果如表1所示。
表1 差異化產地所產枸杞種源的外植區域于葉片及莖段結構處的滅菌表現
根據上述表1試驗數據可得出,當滅菌試劑同殺菌順序被依次限定為75%濃度稀釋酒精以及0.1%濃度稀釋氯化汞溶液時,來自于同類西北區域的不同產地的寧夏、酒泉、張掖種源枸杞在葉片外植組織培育準備階段所進行的最優滅菌耗時設計大致相似[13],其中最具代表性的結構區域位于枸杞葉片組織處,在試驗過程中該區域若想獲得75%左右的成活率,便需要依次開展10 s的75%濃度稀釋酒精滅菌處理以及180 s0.1%濃度稀釋氯化汞溶液殺菌操作,在嚴格執行該滅菌操作后酒泉種源枸杞葉片外植結構存活率可達73.19%,張掖種源枸杞葉片外植結構存活率可達69.18%,寧夏種源枸杞葉片外植結構存活率可達75.68%[14]。
當第一步75%濃度稀釋酒精的殺菌操作時長被限定為10 s,且第二步0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的殺菌操作時長被限定為300~540 s區間內,此時實驗中所涉及的來自3個產地的不同種源枸杞其中葉片部分的外植組織的成活結果將同氯化汞0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的殺菌實際操作用時呈反比例函數關系。事實證明用于滅菌的溶液同樣會損害枸杞的外植葉片區域結構的生命力,在這方面75%濃度的稀釋酒精相較于0.1%濃度稀釋氯化汞溶液殺傷力更強[15]。
當第一步75%濃度稀釋酒精的殺菌操作時長被限定為20s,且第二步0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的殺菌操作時長被限定為60~540 s區間內,此時實驗中所涉及的來自3個產地的不同種源枸杞其中葉片部分的外植組織在0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的殺菌操作初期的180 s內便會出現較陡態勢的下跌函數圖像表現,180 s后函數圖像在漸趨平緩的同時也預示著在這類消毒操作下葉片組織實驗對象所出現的全員枯死狀態[16]。
當第一步75%濃度稀釋酒精的殺菌操作時長被限定為30 s,且第二步0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的殺菌操作時長被限定為60~540 s區間內,此時此時實驗中所涉及的來自3個產地的不同種源枸杞其中葉片部分的外植組織的成活結果以全員死亡告終,尤其顯示了75%濃度稀釋酒精在消殺過度時對枸杞葉片細嫩外植結構的存活威脅,而為了保證目標作物組織的成活效果,最佳消殺方案需要在實際組織培育過程中嚴格控制75%濃度稀釋酒精的作用時長[17]。
根據上述表內試驗數據可得出,當滅菌試劑同殺菌順序被依次限定為75%濃度稀釋酒精以及0.1%濃度稀釋氯化汞溶液時,來自于同類西北區域的不同產地的寧夏、酒泉、張掖種源枸杞在莖段組織培育準備階段所進行的最優滅菌耗時設計各具特色[18]。當第一步75%濃度稀釋酒精的殺菌操作時長被限定為10 s,且第二步0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的殺菌操作時長被限定為300 s時,產于寧夏區域的枸杞種源的莖段外植結構獲得了最大的成活率數值表現,即69.21%;當第一步75%濃度稀釋酒精的殺菌操作時長被限定為20 s,且第二步0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的殺菌操作時長被限定為180 s時,產于酒泉區域的枸杞種源的莖段外植結構獲得了最大的成活率數值表現,即64.54%;當第一步75%濃度稀釋酒精的殺菌操作時長被限定為20 s,且第二步0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的殺菌操作時長被限定為300 s時,產于張掖區域的枸杞種源的莖段外植結構獲得了最大的成活率數值表現,即68.56%[19]。綜上可以見得,相較于柔嫩的葉片外植結構,當選用莖段作為外植體時,莖段內堅韌的細胞壁組織將會賦予目標培養組織相較于葉片區域更強的乙醇消殺耐受能力,只有當3種不同產地的枸杞莖段外植組織在同時面臨長達30 s的75%濃度稀釋酒精的殺菌操作以及長達300 s的0.1%濃度稀釋氯化汞溶液的滅菌的聯合作業時,培養皿內全部的莖段外植體結構才會出現全體凋零枯萎的現象[20]。
通過本文研究得知3類不同產地品種的枸杞在河西地區進行繁殖培養時需要分別對外植體采取有針對性地殺菌操作方案,該方案除了根據其品類種源進行差異化設置外,同種種源枸杞物種的不同的外植體切取部位也要采取不同的殺菌處理操作。在為枸杞提供無菌培養環境時,技術人員第一步需使用75%濃度范圍的稀釋酒精對枸杞外植結構消毒根據實際情況進行長達10~30 s/次的消毒作業,在此基礎上第二步技術人員則需使用0.1%濃度范圍的而氧化汞根據實際情況進行長達1~9 min的外植結構消毒處理。本次研究中指出,在我省河西地區進行枸杞產業化種植時,針對3類差異化產地種源所設計的最適宜的殺菌消毒方案如表2所示。
表2 差異化種原產地枸杞外植結構所適宜的不同殺菌處理方案
在此次西部枸杞外植結構滅菌技術基礎上,現總結適合河西地區的枸杞種植流程如下:需要選擇地形平坦、土壤肥沃、方便灌溉的土地,在移植前1年進行秋季深翻,按照每公頃30000~45000 kg施加有機肥,冬季進行灌溉,種植當年春季進行解凍,解凍后進行淺耕,做成長度為10 m、寬度為1 m的苗床,通過滅菌試劑對枸杞種苗移植床面進行滅菌處理,按照5 cm×5 cm進行打孔;按照上述枸杞外植結構滅菌操作完成枸杞種苗滅菌處理;春季和秋季都能夠進行移植,春季的移植時間一般為3月下旬至4月中旬,秋季的移植時間一般在10月中旬至10月下旬,移植一般按照150~170 cm行株距進行挖穴,挖穴深度為40 cm,挖穴穴徑為30 cm,也照230 cm行株距進行挖穴,挖穴深度為40 cm,挖穴穴徑為60 cm,均需要確保基肥施加的充足程度;移植后通過小拱棚進行保溫保濕處理,結合當天天氣狀況,選擇噴水灌溉,灌溉次數約為每天2~4次,使得小拱棚內部空氣濕度保持在85%~95%,使得土壤濕度保持在25%~35%;當移植時間達到15 d之后,需要減少每天噴水次數。