基于基因組結構變異構建蘿卜種質資源分子身份證

嚴承歡 崔 磊 任志勇 黃 燕，2 矯振彪 朱鳳娟 張振興 甘彩霞 鄧曉輝 邱正明*

（1 湖北省農業科學院經濟作物研究所，蔬菜種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064；2 華中農業大學園藝林學學院，湖北武漢 430070）

蘿卜（L.）又名萊菔，屬于十字花科蘿卜屬植物，富含維生素、膳食纖維、植物蛋白質、硫代葡萄糖苷等多種營養物質。蘿卜的栽培歷史超過4 500 年，最早由古埃及人將其馴化并栽 培（Becker，1962；Zhang &Wang，2017）。在我國，蘿卜常年種植面積約120 萬hm，總產量約4 000 萬t（包崇來 等，2019）。肉質根是蘿卜的主要食用器官，根據其皮色可分為白皮、綠皮、紅皮以及黑皮等類型，其中白皮蘿卜是目前最主要的栽培類型（崔志超 等，2020）。

隨著生物技術的發展，已形成多種類型分子標記，如限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機擴增多 態 性DNA 標 記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）、插入/缺失標記（insertion/deletion，InDel）和單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）等（Toal et al.，2016）。其中，RFLP、RAPD、AFLP 和SSR分子標記在基因組中數目較少；SNP 分子標記數量最多，但開發成本和檢測成本高昂。InDel 分子標記具有標記數目多、準確性高以及共顯性等特點，但因其插入/缺失序列小于50 bp，需要采用聚丙烯酰胺凝膠進行檢測（Shu et al.，2018）。若將插入/缺失變異提升至50 bp 以上序列，采用普通瓊脂糖凝膠電泳即可完成檢測，可顯著提升該類型標記的檢測效率。一般而言，50 bp 以上的插入/缺失變異屬于基因組結構變異（structural variants，SVs）范疇（Alkan et al.，2011）。目前，基因組結構變異已廣泛應用于人類的基因分型相關工作，但在植物中研究相對較少。在植物中，研究人員已利用SSR、InDel 等分子標記構建了甜高粱（王黎明等，2011）、甘藍型油菜（馬琳 等，2013）、水稻（陸徐忠 等，2014）、大白菜（劉栓桃 等，2019）和青花菜（管俊嬌 等，2021）等多個物種的分子身份證。然而，采用較大片段（50～500 bp）的插入/缺失變異開發易于檢測（如使用瓊脂糖凝膠即可檢測）的分子標記，并以此構建分子身份證的研究尚未見報道。

本試驗采用最近報道的520 份蘿卜簡化基因組測序數據以及蔬菜種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室完成的4 份蘿卜全基因組重測序數據進行聯合分析，開發具有廣泛通用性的蘿卜分子標記。這些標記通過瓊脂糖凝膠電泳即可完成基因型檢測。采用以上分子標記對已收集的255 份蘿卜種質資源進行基因分型，構建其相應的分子身份證，明確不同種質間的親緣關系。本試驗所得標記可用于育種材料的背景選擇、雜種鑒定等基礎性工作，為蘿卜種質鑒定及分子育種工作提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為湖北省農業科學院經濟作物研究所蘿卜團隊收集的255 份蘿卜核心種質，主要包括優良地方品種自交系和育種材料等。2020 年9 月13日將上述材料播種于湖北省農業科學院蔬菜基地。每份材料6～10 株，株距25 cm，行距32 cm，常規種植管理。

1.2 DNA 提取

采用CTAB 法（Webb &Knapp，1990）提取植物基因組DNA，略加修改。每份蘿卜種質選取6 株1 月齡幼苗，取等量葉片混合，放入2 mL 離心管；加入800 μL CTAB（1.5%，/）提取液，使用磨樣機（TissueLyser-64，上海凈信實業發展有限公司）磨樣90 s，然后65 ℃水浴30 min，期間顛倒振蕩3 次；加入600 μL 24∶1（/）的氯仿∶異戊醇，上下顛倒混勻5 min，室溫10 000 r·min離心10 min；吸取500 μL 上清液，放入新的1.5 mL 離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻50 次，室溫12 000 r·min離心15 min，棄上清液；加入1 mL 75%酒精清洗2 次，棄酒精，吸取多余液體，室溫吹干；加入200 μL ddHO，室溫溶解30 min，-20 ℃保存備用。

1.3 引物設計

為提高分子標記的通用性，采用蔬菜種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室完成的4 份蘿卜全基因組重測序數據（ENA 登記號：ERP128830）和已公布的520 份蘿卜簡化基因組測序數據（Kitashiba et al.，2020）進行分子標記開發。全基因組重測序在北京貝瑞和康生物技術有限公司Illumina Novaseq 6000 測序平臺完成，每份樣品獲得約6 GB 數據量。采用已公布的蘿卜基因組QZ-16（ENA 登記號：PRJEB37015）為參考基因組，使用Bowtie 2（Langmead &Salzberg，2012）進行數據比對，利用GATK 4.0 進行插入/缺失位點鑒定，引物設計標準：①在520 份蘿卜簡化基因組測序數據以及4份蘿卜全基因組重測序數據中選擇含有0/0 和1/1兩種不同的基因型類別，且4 份重測序材料基因型不同；② 插入/缺失位點序列差異大于50 bp；③變異位點在所有材料中的丟失率小于0.9，等位基因頻率大于0.05，每1 Mb 選擇1 個位點；④ 引物設計選擇數據質量（quality）400 以上的插入/缺失位點；⑤ 設計引物盡可能均勻分布于每條蘿卜染色體上。基于以上標準，采用Primer3Plus（https：//primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）設計引物，一共設計了92 對分子標記，隨機選取24 份蘿卜種質用于分子標記篩選。

1.4 PCR 擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR 擴 增 采 用11 μL 反 應 體 系：2× EsMasterMix（北京康為世紀生物科技有限公司）5 μL，10 nmol·L正、反向引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，ddHO 3 μL。PCR 擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，50～63 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環38 次；72 ℃延伸5 min。PCR 產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，實時凝膠成像系統Gel Doc XR+（Bio-Rad 公司，美國）進行拍照。

1.5 數據賦值及分子身份證編碼

對電泳條帶進行賦值，規則如下：①若擴增產物為單一條帶，將遷移率較大的條帶賦值為0，遷移率較小的條帶賦值為1；② 同時出現遷移率較大和較小的雜合條帶時，重新選取6 個該樣本單株材料，分別提取DNA，重新進行基因型鑒定，當50%以上植株均為雜合時確定其為雜合型，賦值為2；③若出現缺失條帶類型時，重新提取該樣本DNA，重新進行基因型鑒定，若結果仍為缺失帶型，賦值為X。

按照蘿卜染色體Rs1～Rs9 順序對引物進行排序。同一條染色體上的引物，按照物理位置大小進行排序。依據上述賦值規則，采用24 對引物（表1）對255 份蘿卜種質進行PCR 擴增并賦值，形成原始賦值數據。最后將24 位賦值結果數據進行合并，完成蘿卜種質的分子身份證構建。

表1 構建蘿卜分子身份證的引物信息

1.6 親緣關系分析

使用NTSYS-pc（v2.1）軟件對蘿卜種質進行聚類分析。將基于PCR 賦值結果建立的0，1 矩陣導入到軟件中，采用UPGMA 法進行聚類，最終繪制聚類圖。

2 結果與分析

2.1 篩選目標分子標記

隨機選取24 份蘿卜種質，對初步設計的92 個分子標記進行篩選。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，92個分子標記中有25 個標記含有3 種或3 種以上條帶，43 個標記無多態性或存在較多無PCR 產物情況，僅24 個標記含有2 種條帶（圖1）。最終，篩選24 個標記為目標分子標記。

圖1 9 個分子標記在部分蘿卜種質中的PCR 擴增結果

2.2 構建蘿卜種質分子身份證

參照賦值標準，對255 份蘿卜種質進行分子身份證構建。按照蘿卜基因組QZ-16 上染色體順序Rs1～Rs9 及其分子標記所在物理位置進行排序，獲得由24 位數字編碼組成的蘿卜分子身份證（表2）。

表2 255 份蘿卜種質的分子身份證

續表

續表

續表

參試255 份蘿卜種質中，僅16 份材料的24 個標記均為純合型（帶型僅為0 和1）；39 份材料在24 個SV 標記中有1 個位點為雜合型（帶型為2），其余位點均為純合型帶型。此外，R033～R055 為商品種，采用24 個分子標記對其進行基因分型，發現商品種材料的雜合位點數目為4～11 個，其中R045（京紅6 號）、R048（沙窩）和R051（短葉13）含有4 個雜合位點，是雜合等位基因較少的蘿卜商品種，推測可能是由于父母本親緣關系較近或者為多代自交所致。

1.3 蘿卜種質聚類分析

使用NTSYS-pc（v2.1）軟件對255 份蘿卜種質進行聚類分析。結果表明（圖2），在相關系數0.55 處可將參試蘿卜種質分為4 個類群。其中，多個材料間具有較高的相似性，如R001 和R152、R107 和R125、R066 和R106 等。

圖2 基于SV 標記的255 份蘿卜種質聚類分析結果

3 結論與討論

本試驗利用520 份蘿卜簡化基因組測序數據和4 份蘿卜全基因組重測序數據，開發了24 個具有通用性的分子標記，并以此構建了參試255 份蘿卜種質的分子身份證。同時，利用以上分子標記的基因分型數據，完成了255 份蘿卜種質的親緣關系鑒定，在相關系數0.55 處將參試蘿卜種質分為4 個類群，其中多個材料間具有較高的相似性，如R001 和R152、R107 和R125、R066 和R106 等。田間調查發現這些材料表型接近，推測以上高相似性種質可能為不同收集來源的同種材料。該結果將為后續蘿卜核心種質的篩選及創制提供技術支撐。

隨著分子生物學的快速發展，蔬菜作物已完成多個分子身份證的構建，如黃瓜（李斯更 等，2013）、菜薹（菜心）（郭培國 等，2014）、芥菜（王玉紅，2016）、大白菜（劉栓桃 等，2019）等。蘿卜的分子身份證研究起步較早，2014 年邱楊等利用SSR 標記對75 份蘿卜種質進行基因分型，首次完成了蘿卜分子身份證的構建（邱楊 等，2014）。以上研究中，多為基于SSR 標記技術的分子身份證構建，僅少數采用InDel 標記技術，如黃瓜、大白菜（李斯更 等，2013；劉栓桃 等，2019）。然而，在黃瓜和大白菜的分子身份證構建中插入/缺失序列的變異幅度較小（≈ 5 bp），須采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。本試驗利用生物信息學技術選擇大于50 bp 的結構變異，開發并獲得了24 個通用性的分子標記，均采用普通瓊脂糖凝膠電泳即可完成基因分析和相關檢測。可見，采用以上分子標記對不同蘿卜種質進行基因分型以及背景選擇，將極大地降低蘿卜材料的分子檢測成本，同時顯著提升蘿卜分子育種的效率。此外，SSR 分子標記具有高多態性特點，在1 個位點的多態性大于2 個，這對PCR 產物的賦值及標準化提出了挑戰。基于物種水平的大數據分析，可在一個物種水平上鑒定通用性的分子標記，篩選多態性為2 個的分子標記，可以實現數據的標準化賦值，有利于構建統一的分子身份證數據庫。

綜上所述，基于基因組水平大片段序列插入/缺失變異，本試驗開發了僅需瓊脂糖凝膠電泳檢測的24 個通用性分子標記，構建了255 份蘿卜種質的分子身份證，并完成了其親緣關系鑒定。本試驗的開展，一方面將有利于提升蘿卜分子標記的檢測效率及其標準化賦值水平，另一方面將為蘿卜新種質的鑒定與背景選擇提供寶貴信息資源。