番茄立枯病菌拮抗菌B4-8的鑒定及生防作用評價

藍達愉 李鳳芳 何廣潔 許萌杏 吳小剛 黎起秦 林 緯 袁高慶

（廣西大學農學院，廣西南寧 530004）

立枯絲核菌（）寄主范圍廣泛，可侵染多種作物引起立枯病、紋枯病和莖基腐病。其中番茄立枯病是番茄苗期以及移栽初期的主要病害之一，大田期還常常造成莖基腐病，在常年連作或輪作年限短的番茄主產區發生為害尤其嚴重（韓云 等，2015）。目前防治番茄立枯病的方法主要是通過使用化學藥劑以及加強苗期農業措施管理，但長期使用化學藥劑易使病原菌產生抗藥性并引起污染環境等問題，而農業措施有時實施不到位，達不到及時有效控制病害的目的。生物防治被認為是重要的綠色防控技術，具有安全無污染、可持續發揮控制作用的特點，尤其適用于土傳病害的防治。挖掘有益的生防菌是對番茄立枯病實施生物防治的前提。

本試驗前期工作中，從采自廣西和北京市郊的18 份土樣中分離到672 株細菌菌株。以番茄立枯病菌作為靶標病原菌，通過平板抑菌活性測定，獲得具有拮抗作用的細菌菌株57 株，其中菌株B4-8對靶標病菌的抑制作用最強（資料未發表）。本文擬對該菌株進行鑒定，測定其抑菌譜和對番茄立枯病的室內防治作用，并初步分析其生防機制和安全性，探討其生防價值，為利用該菌株防治番茄立枯病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

病原菌：番茄立枯病菌（）、苦瓜枯萎病菌（）、香蕉煤紋病菌（）、煙草莖點霉葉斑病菌（）、柑橘沙皮病菌（）和蘋婆炭疽病菌（），由廣西大學植物病理研究室提供。

生防菌：菌株B4-8 由廣西大學農學院植物病害生物防治課題組成員前期從土壤中分離獲得，保存于廣西大學植物病理研究室。對照生防菌株熒光假單胞菌（）2P24 和Pf-5分別高產生物膜、抗生素硝吡咯菌素，由廣西大學吳小剛博士提供。

供試番茄品種：真龍2 號，廣州市大農園藝種子有限公司生產。

King’B 培養基：甘油10 mL，蛋白胨20.0 g，七水硫酸鎂1.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。NA 培養基：酵母粉3.0 g，蛋白胨5 g，蔗糖10 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。蛋白酶檢測培養基：蛋白胨10.0 g，氯化鈉0.5 g，氯化鈣0.1 g，脫脂奶粉10.0 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。以上培養基pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min 備用。麥麩培養基：以麥麩與蒸餾水質量比為5∶4 的比例混合，分裝于三角瓶中，121℃滅菌30 min，連續滅菌2 次后備用。

1.2 供試菌株培養

生防細菌菌株的培養：取保存在-80 ℃的菌株B4-8 于NA 培養基平板上28 ℃下活化，挑取單菌落于NA 固體培養基上或NB 液體培養基中28 ℃下培養24 h，待用。

病原菌的培養：將用于抑菌譜測定的病原菌接于PDA 培養基上，在28 ℃下培養3 d 待用。另將用于接種的番茄立枯病菌菌落切成小塊，以10%的接種量移入麥麩培養基中，28 ℃培養7 d，倒出自然晾干后搗碎，制成接種物。

1.3 菌株B4-8 的鑒定

常規鑒定：描述菌落特征，進行菌體革蘭氏染色和生理生化性狀測定（東秀珠和蔡妙英，2001），用透射電鏡觀察菌體形態。

分子鑒定：采用通用引物16S-63F（5′-CAGG CCTAACACATGCAAGTC-3′）和16S-1387R（5′-GGGCGGTGATGTACAAGGC-3′）擴增菌株16S rDNA 序 列（Marchesi et al.，1998）。PCR 擴 增 體系（50 μL）為：DNA 模板4 μL，16S-63F 2 μL，16S-1387R 2 μL，mix 25 μL，ddHO 17 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸110 s，循環35 次；72℃修復延伸7 min；4 ℃保存待用；用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產物送生工生物工程（上海）股份有限公司純化并測序。之后將序列與GenBank數據庫中現有序列進行同源性比對，并進行系統發育分析。

1.4 菌株B4-8 的抑菌譜及其對番茄立枯病的室內防治作用測定

1.4.1 抑菌譜測定 采用平板對峙培養法測定。在PDA 平板中央接種直徑7 mm 的病原真菌菌餅，在距離病原真菌菌餅2 cm 處接種菌株B4-8 懸浮液5 μL，以僅接種病原真菌菌餅未接菌株B4-8 的處理為對照，每處理設3 次重復，每個重復設3 皿，于28 ℃恒溫箱中培養3～5 d，測量各病原菌的菌落面積，計算抑菌率。

抑菌率（%）=〔（對照組菌落面積 -處理組菌落面積）/對照組菌落面積〕 × 100

1.4.2 對番茄立枯病的防治作用測定 番茄幼苗長至10 cm 高時，將其移栽于含有基質、泥土、牛糞（1∶5∶1）的種植缽中，每缽1 株。番茄第5 片葉長出后，將在NB 培養液中振蕩培養24 h 的菌株B4-8 菌液濃度調成OD為0.20～0.25（即菌液濃度約為1 × 10cfu·mL），灌施于番茄幼苗根部，每株30 mL 菌液。以灌施30 mL 清水作為對照，以50%啶酰菌胺水分散粒劑（巴斯夫歐洲公司生產）有效成分133.3 mg·kg的處理作為藥劑對照。接種生防菌2 d 后，將在麥麩培養基中培養7 d 的立枯絲核菌以每株0.25 g 的量接種于番茄幼苗莖基部周圍并蓋上1 層細土。每處理設3 次重復，每個重復10 株番茄。接種病原菌5 d 后對番茄立枯病發病情況進行調查。

發病率（%）=〔（發病株數/總株數）〕× 100

防治效果（%）=〔（對照組發病率 -處理組發病率）/對照組發病率〕× 100

1.5 菌株B4-8 生防作用機制初步分析

1.5.1 生物膜產量和胞外酶活性測定 生物膜產量的測定：取菌株B4-8 新鮮菌液以2%的接種量接種于含有1 mL NA 培養液的EP 管中混勻，于28 ℃條件下靜置培養1 d，倒去菌液，用無菌水沖洗一遍后，加入1 mL 的1%結晶紫染液染色15 min，用無菌水將染液沖洗1 次，置于室溫下吹干，每管用1 mL 的95%乙醇反復用移液器輕輕抽打，徹底將離心管內壁上形成的紫環沖洗下來，在600 nm 處測定吸光度值。以高產生物膜的生防菌株2P24 為對照菌，分別設置3 次重復，每個重復設3 管。

另外取5 μL 新鮮菌液分別接種于蛋白酶和幾丁質酶檢測培養基平板中（石磊 等，2013），置于28 ℃條件下分別培養2 d 和5 d，觀測菌落周圍透明水解圈大小。每處理設置3 次重復，每次重復設3 皿。

1.5.2 硝吡咯菌素及其合成相關基因檢測 將新鮮B4-8 菌株接種到NA 平板上，置于28 ℃下培養7 d，將培養基切碎后轉移到100 mL 三角瓶中，加入50 mL 乙酸乙酯，37 ℃下振蕩90 min，室溫靜置5 min，收集上清旋轉蒸發，獲得硝吡咯菌素粗提物，用100 μL 甲醇溶解，以氯仿與丙酮混合物（19∶1）為展開劑進行薄層 層 析（張 清 霞 等，2018）。按 照Mavrodi 等（2001）描述的方法，對菌株B4-8 產生硝吡咯菌素的基因進行PCR 檢測，引物為prnCF：5′-CCACAAGCCCGGCCAGGAGC-3′，prnCR：5′-GAGAAGAGCGGGTCGATGAAGCC-3′。PCR擴增體系（50 μL）為：DNA 模板4 μL，上下游引物各2 μL，mix 25 μL，ddHO 17 μL。PCR 擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 50 s，循環35 次；72℃修復延伸7 min；用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以上檢測均以菌株Pf-5 作為陽性對照。

取B4-8 菌株硝吡咯菌素粗提物5 μL，按照1.4.1中的方法測定其對番茄立枯病菌的抑菌率，分別以新鮮菌液、Pf-5 硝吡咯菌素粗提物和甲醇作對照。

1.6 菌株B4-8 安全性測定

1.6.1 對洋蔥致病性的測定 選取健康的洋蔥鱗片，采用針刺與浸泡的方法對洋蔥進行接種試驗，菌株B4-8 接種濃度為1 × 10cfu·mL，以同樣方法接種無菌水作為對照，設置3 次重復，每個重復設1 塊洋蔥鱗片，每塊洋蔥鱗片接種4 處，觀察發病癥狀。

1.6.2 對人體安全性的測定 首先檢測菌株B4-8是否具有毒力基因BCESM（epidemic strain marker）：按Mahenthiralingam 等（1997）的方法擴增BCESM 基因，PCR 擴增反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環30 次；72 ℃修復延伸10 min；4 ℃保存待用。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外采用生菜葉中脈致病模型進行檢測（Ibrahim et al.，2012）：選用新鮮健康的葉用萵苣（生菜）葉，采用針刺法接種濃度為1 × 10cfu·mL的B4-8 菌株于生菜葉中脈，以接種無菌水作為對照，設置3 次重復，每個重復接種1 片葉片，在葉片中脈接種3 處，觀察發病癥狀。

1.7 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 2010 和DPS 7.05 軟件進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 菌株B4-8 的鑒定

2.1.1 形態學特征 在NA 培養基上培養24 h 后，菌株B4-8 菌落呈圓形或近圓形，產生黃綠色熒光色素，表面稍凸起，水潤且粘稠，邊緣整齊或不整齊。在透射電鏡下，菌體（圖1）呈短桿狀，大小為（1.63～2.25）μm ×（1.0～1.5）μm，單端叢生鞭毛。

圖1 菌株B4-8 的菌體形態透射電鏡圖

2.1.2 生理生化特性 菌株B4-8 革蘭氏染色陰性，能進行反硝化反應，可產生氧化酶，可水解精氨酸、明膠、淀粉，可利用鼠李糖、麥芽糖、檸檬酸鹽、2，3-丁二醇。根據菌落和菌體形態、革蘭氏染色反應和生理生化特征，初步將菌株B4-8 歸屬為伯克氏菌屬。

2.1.3 分子生物學鑒定 菌株B4-8 的16S rDNA序列雙向測序后，經在NCBI 上進行比對，與多株洋蔥伯克氏菌（）菌株的相似性達到99%。選取伯克氏菌不同種的代表菌株構建系統發育樹（圖2），菌株B4-8 與洋蔥伯克氏菌（MG923808）處于同一分支內。結合形態學及生理生化特征，將菌株B4-8 鑒定為洋蔥伯克氏菌。

圖2 菌株B4-8 的16S rDNA 系統發育樹

2.2 菌株B4-8 的抑菌譜以及對番茄立枯病的防治作用

2.2.1 抑菌譜 菌株B4-8 對6 種植物病原真菌均表現出較強的抑菌活性，抑菌率為52.64%～68.27%。其中B4-8 對番茄立枯病菌的拮抗能力表現最強，對蘋婆炭疽病菌的拮抗能力表現最弱（表1）。

表1 生防菌B4-8 對供試病原真菌的抑菌率

2.2.2 對番茄立枯病的防治作用 菌株B4-8 對番茄立枯病的室內防治效果達71.43%，與化學藥劑50%啶酰菌胺水分散粒劑使用有效成分133.3 mg·kg劑量的防效相當（表2）。

表2 菌株B4-8 對番茄立枯病的防治作用

2.3 菌株B4-8 的生防機制

2.3.1 生物膜的形成 結晶紫染色法測定B4-8菌株生物膜合成的結果顯示，以熒光假單胞菌（）菌株2P24 作為對照，2 株菌株在EP 管培養液與空氣交界處的管壁上都可形成一道清晰的紫色環痕，用95%乙醇將紫色環痕洗脫下來后，在600 nm 處的吸光度值分別為1.098 和1.042，二者的吸光度值相比未達到差異顯著水平，說明生防菌B4-8 生物膜合成量與熒光假單胞菌2P24 處于同一水平。

2.3.2 產生的代謝物質 水解圈測定結果顯示，菌株B4-8 在含蛋白質和幾丁質平板上產生明顯的水解圈，其半徑分別為1.0 cm 和 0.3 cm，表明該菌株可產生蛋白酶和幾丁質酶等抗菌代謝物。抗生素硝吡咯菌素基因檢測結果顯示，該菌株存在片段為720 bp 左右的基因（圖3-a）。通過薄層層析法進一步驗證菌株B4-8 可產生抗生素硝吡咯菌素（圖3-b）。

圖3 菌株B4-8 產生硝吡咯菌素的檢測及驗證

2.3.3 硝吡咯菌素對番茄立枯病菌的抑制作用 菌株B4-8 產生的硝吡咯菌素粗提物對番茄立枯病菌具有較強的抑制作用，且強于對照菌株Pf-5 產生的硝吡咯菌素粗提物對病菌的抑制作用（圖4）。

圖4 菌株B4-8 硝吡咯菌素粗提物對番茄立枯病菌的拮抗作用

2.4 菌株B4-8 的安全性

試驗結果表明，采用針刺法與浸泡法接種洋蔥，菌株B4-8 都不能使洋蔥致病。對其基因組DNA 進行PCR 擴增，未檢測到BCESM 毒力基因。采用生菜葉中脈致病模型驗證菌株B4-8 的致病性，結果顯示B4-8 不能使生菜葉中脈發病。以上結果說明，菌株B4-8 用于防治植物病害應當是安全可靠的。

3 討論

伯克氏菌（spp.）屬于變形菌門（Proteobacteria）細菌，有62 個種，廣泛存在于土壤、水體和動植物等環境中（Suare-moreno et al.，2011）。部分spp.菌株可以有效地控制一些作物土傳病害的發生，如JX-1 對番茄青枯病的室內防效能達到80.89%（許萌杏 等，2021）。spp.用于防治植物病害的種類還有：抑制瓜果腐霉（）的、抑制終極腐霉菌（）的、抑制鐮刀菌（sp.）的、抑制辣椒疫霉（）的、抑制灰葡萄孢菌（）的和抑制立枯絲核菌的（況衛剛，2016）。洋蔥伯克氏菌原命名為洋蔥假單胞菌（），因其能引起洋蔥鱗莖腐爛，于1950 年首次作為植物病原菌報道（Burkholder，1950），1992 年被歸到屬（Yabuuchi et al.，1992）。又因不同菌株在基因水平上的差異，被統稱為洋蔥伯克氏菌群（complex，簡稱Bcc）。目前明確歸入到Bcc菌群里的有10個不同的基因型（Ⅰ～Ⅹ）。但近年來不斷有新的基因型被發現，且由于不同基因型的菌株之間的DNA 雜交率很低，因此可將洋蔥伯克氏菌一個基因型作為1 個種，目前已有22 個種（Rojas-Rojas et al.，2019）。感染人的幾乎都是Ⅲ型菌（）和Ⅱ型菌（），其中大部分屬于Ⅲ型菌。

Bcc 菌株應用于植物病害防治的基因型主要有Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ型，在植物病害防治中具有良好潛能（Rohini et al.，2019）。本試驗發現，菌株B4-8 對番茄立枯病具有較好的室內防治效果，與化學藥劑50%啶酰菌胺水分散粒劑使用有效成分133.3 mg·kg劑量的防效相當。

明確生防菌的生防機制可為提高其生防效果提供科學依據。Nacamulli 等（2006）發現，Bcc 菌株可迅速定殖玉米植株成為優勢菌株，造成玉米根際微生物系統紊亂。生物膜的產生被認為是與生防菌定殖能力密切相關的重要因子（Danhorn &Fuqua，2007），本試驗發現，菌株B4-8 具有較強的生物膜形成能力，暗示該菌株可能具有較強的定殖能力。但該菌株是否可在番茄根際形成優勢種群和有效地抑制番茄立枯病菌入侵寄主，還有待進一步深入探究。

Bcc 菌株可以分泌幾丁質酶、淀粉酶和纖維素酶等多種胞外酶（張立新 等，2006），還可產生多種抗生素，包括硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）、吩嗪（phenazine）、蔥假胞素（cepacin）等以及其他未鑒定的化合物（De-Souza &Raaijmakers，2003）。硝吡咯菌素對病原真菌的抑菌機制主要在于抑制葡萄糖磷酰化有關的轉移，并抑制菌絲的生長。本試驗發現，菌株B4-8 可以產生蛋白酶、幾丁質酶、硝吡咯菌素等胞外代謝物，且硝吡咯菌素對番茄立枯病菌有較強的抑制作用，推測B4-8 產生的胞外酶和硝吡咯菌素是該菌株發揮拮抗作用的重要生防因子。

Bcc 菌株在生物防治上有很大的潛力，但也存在對植物和人體致病的風險，需要對其進行安全性評價。基因BCESM 是已被證實的與人體致病相關的遺傳基因，且被作為Bcc 生防菌致病性評估的一個指標（Mahenthiralingam et al.，1997）。不同的致病模型之間存在一定程度上的差異性，有研究表明，采用生菜模型及擬南芥模型與小白鼠模型的結果呈現高度一致（Ibrahim et al.，2012）。本試驗對菌株B4-8 的BCESM 基因進行檢測，結果未發現該菌株存在BCESM 基因，采用生菜葉進行致病性驗證的結果與毒力基因檢測結果一致，且對洋蔥不致病，初步表明菌株B4-8 對人和植物安全。

當前Bcc 菌株對人和作物致病機制尚未完全明晰，其抗生素的拮抗機制也有待深入研究，在許多問題還未探索清楚之前，應當對其采取嚴格的管控措施，避免產生不必要的風險。然而目前菌株B4-8 在多方面表現出良好的生防潛力，對其進行深入的研究很有意義和價值。后續計劃開展田間試驗驗證其生防效果，然后進行相關安全性試驗，包括大鼠急性經口毒試驗、家兔急性皮膚刺激試驗等，進一步確定菌株B4-8 的毒性，并結合分子技術深入研究該菌株的生防機制與抗生素調控機理，為今后該菌株在生物防治中的安全應用提供理論指導。

4 結論

菌株B4-8 被鑒定為洋蔥伯克氏菌，其對番茄立枯病菌的室內防效達71.43%，可通過產生蛋白酶、幾丁質酶及硝吡咯菌素等拮抗物質發揮防病作用，初步表明對人體和植物安全，具有防治番茄立枯病的潛力。