游離亞硝酸對(duì)亞硝酸鹽氧化菌活性的抑制作用機(jī)制

楊昕怡，常煥煥，于 雪，李曉強(qiáng)，王光杰，孫洪偉,*

(1.蘭州交通大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.煙臺(tái)大學(xué)環(huán)境與材料工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000；3.山東同濟(jì)測(cè)試科技股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264000)

硝化反應(yīng)包括亞硝化和硝化兩步反應(yīng)，第一步：氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)將氨氮氧化成亞硝酸鹽；第二步：亞硝酸鹽氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)將亞硝化反應(yīng)生成的亞硝酸鹽進(jìn)一步氧化為硝酸鹽。AOB和NOB屬于典型的化能自養(yǎng)菌，銨鹽和亞硝酸鹽[1-3]通過這兩種細(xì)菌的作用最終轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。雖然NOB從氧化亞硝酸鹽這一過程中獲得生命活動(dòng)需要的能量，但是大多NOB對(duì)周圍環(huán)境中亞硝酸鹽濃度的高低非常敏感[2,4]，并不是亞硝酸鹽濃度越高越好。

硝化反應(yīng)過程中，F(xiàn)NA是NOB的基質(zhì)底物，又是一種NOB活性抑制劑。當(dāng)FNA濃度較低時(shí)，能夠加快亞硝酸鹽的氧化反應(yīng)，但同時(shí)基于底物抑制動(dòng)力學(xué)，當(dāng)FNA濃度較高時(shí)，又會(huì)對(duì)NOB活性產(chǎn)生抑制作用。因此，硝化反應(yīng)過程中真正的抑制劑是FNA[8-10]。孫洪偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NA對(duì)NOB活性具有顯著抑制影響，該抑制影響可通過基質(zhì)抑制動(dòng)力學(xué)模型描述，且具有明顯的分段現(xiàn)象。當(dāng)0.004 mg·L-1≤FNA≤0.178 mg·L-1，隨著FNA濃度增加，NOB活性逐漸增強(qiáng)，表明該濃度條件下，F(xiàn)NA會(huì)提高NOB活性；當(dāng)0.191 mg·L-1≤FNA≤0.702 mg·L-1時(shí)，NOB活性隨著FNA濃度的增加呈降低趨勢(shì)，表明該濃度條件下，F(xiàn)NA可能抑制了NOB的活性；當(dāng)FNA>0.702 mg·L-1時(shí)，NOB幾乎沒有活性，表明NOB活性被完全抑制。

目前，尚未有基于富集NOB的SBR系統(tǒng)中開展FNA對(duì)NOB的抑制動(dòng)力學(xué)及亞硝酸鹽氧化功能基因的相關(guān)研究。作者以長(zhǎng)期富集的NOB菌屬為研究對(duì)象，通過動(dòng)力學(xué)模型探究不同pH 值(6.5、7.0、8.0)條件下，F(xiàn)NA對(duì)NOB菌屬活性的抑制動(dòng)力學(xué)影響，篩選能夠準(zhǔn)確描述該抑制影響的動(dòng)力學(xué)模型，并結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，考察不同pH值條件下亞硝酸鹽氧化還原酶基因(nxrA和nxrB)的變化規(guī)律，從生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)兩方面闡述FNA對(duì)NOB活性的抑制機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)用水及接種污泥

接種污泥，取自蘭州市某污水處理廠氧化溝工藝的活性污泥，具有良好的生物脫氮性能和硝化功能，其混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度(MLVSS)為830 mg·L-1。

1.2 方案

1.3 熒光定量PCR技術(shù)

絕對(duì)定量PCR(absolute quantification PCR，AQ-PCR)技術(shù)是先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(由拷貝數(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)出)，然后測(cè)定未知樣品的閾值循環(huán)(Ct)值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推出該樣品的起始濃度，以達(dá)到絕對(duì)定量樣品基因mRNA、DNA 分子拷貝數(shù)的目的。樣品在測(cè)定過程中，需要同時(shí)對(duì)未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR循環(huán)，未知樣品cDNA 的起始拷貝數(shù)是通過將未知樣品的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合起來而得出。把PCR 擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)定義為Ct值，其具有重現(xiàn)性。質(zhì)粒DNA、RNA和ssDNA都可以作為測(cè)定過程中的標(biāo)準(zhǔn)品使用。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的功能基因和PCR引物信息[13]見表1。

表1 功能基因和PCR引物信息Tab.1 Information of functional gene and PCR primer

按式(1)計(jì)算拷貝數(shù)(X0)：

Ct=-KlogX0+b

(1)

式中：K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距。

至此，中國(guó)掀起了大規(guī)模建設(shè)高速公路的熱潮。如今中華大地上突破13萬公里的高速公路織密成網(wǎng)，大大縮短了時(shí)間和空間距離，帶來了發(fā)展新動(dòng)力，成就舉世矚目。

1.4 基質(zhì)抑制動(dòng)力學(xué)模型

(1)Haldane模型[14]

1930年，Haldane發(fā)現(xiàn)在生化反應(yīng)過程中，基質(zhì)底物和催化作用的酶會(huì)形成酶-底物的中間復(fù)合物，該中間復(fù)合物會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，建立了Haldane模型(式2)來描述這種抑制影響。

(2)

(2)Aiba模型[15]

1968年，Aiba等發(fā)現(xiàn)酒精的發(fā)酵產(chǎn)物能夠顯著抑制微生物的生化反應(yīng)過程，建立了產(chǎn)物抑制模型(式3)。

(3)

(3)Edwards模型[16]

1970年，Edwards建立了基質(zhì)抑制動(dòng)力學(xué)模型(式4)，該模型被廣泛應(yīng)用于描述硝化反應(yīng)過程中基質(zhì)底物對(duì)微生物活性的抑制作用。

(4)

(4)Luong模型[17]

1987年，Luong建立了用于描述基質(zhì)底物濃度對(duì)微生物增殖過程的影響的動(dòng)力學(xué)模型(式5)。

(5)

上述式中：S為底物濃度，mg·L-1；r為底物的比降解速率，d-1；rmax為微生物最大比降解速率，d-1；KS為半飽和常數(shù)，mg·L-1；KI為抑制常數(shù)，mg·L-1；P為產(chǎn)物濃度，mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 NOB富集系統(tǒng)內(nèi)活性污泥微生物菌群特性

NOB富集系統(tǒng)屬水平的微生物群落組成結(jié)構(gòu)(3個(gè)平行樣品)如圖1所示。

圖1 NOB富集系統(tǒng)屬水平微生物群落組成結(jié)構(gòu)Fig.1 Microbial community composition at genus level in NOB enrichment system

2.2 FNA對(duì)NOB活性的抑制動(dòng)力學(xué)

為了探究FNA對(duì)NOB活性的抑制動(dòng)力學(xué)影響，通過批次實(shí)驗(yàn)獲得了不同F(xiàn)NA濃度在3種pH值條件下的比亞硝酸鹽氧化速率(SNiOR)，并采用上述4種基質(zhì)抑制動(dòng)力學(xué)模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖2所示。

(a)pH=6.5 (b)pH=7.0 (c)pH=8.0圖2 FNA對(duì)NOB活性抑制動(dòng)力學(xué)模型的擬合曲線Fig.2 Fitting curves for kinetic model of inhibition on NOB activity by FNA

從圖2可以看出，在3種pH值條件下，SNiOR的變化規(guī)律均適合Haldane模型、Aiba模型和Edwards模型，動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線均呈先上升后下降的趨勢(shì)。此外，當(dāng)pH值為6.5時(shí)，Luong模型也可以很好地反映FNA對(duì)SNiOR的影響。因此，上述4種基質(zhì)動(dòng)力學(xué)模型均可描述FNA對(duì)NOB活性的抑制影響。

在3種pH值條件下，當(dāng)FNA濃度較低時(shí)，即pH=6.5，F(xiàn)NA<0.07 mg·L-1；pH=7.0，F(xiàn)NA<0.21 mg·L-1；pH=8.0，F(xiàn)NA<0.08 mg·L-1，隨著FNA濃度的增加，SNiOR均表現(xiàn)出顯著加快的趨勢(shì)，NOB活性顯著增強(qiáng)，也就是說，在較低的FNA濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)NA對(duì)NOB的活性具有顯著的促進(jìn)作用。然而，當(dāng)FNA濃度高于上述臨界濃度時(shí)，隨著FNA濃度的增加，SNiOR卻逐漸減慢，NOB活性逐漸被抑制。因此，F(xiàn)NA對(duì)NOB的活性表現(xiàn)出明顯的“低促高抑”的影響規(guī)律。

當(dāng)基質(zhì)底物為FNA時(shí)，采用Haldane模型、Aiba模型和Edwards模型均能較好地描述FNA對(duì)NOB活性的抑制影響，但是分析統(tǒng)計(jì)參數(shù)(RSS、R2、F、P)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Aiba模型的RSS較小，R2較大，F(xiàn)值最大，P值最小。因此，綜合考慮，Aiba模型最適宜描述FNA對(duì)NOB活性的抑制影響。

不同pH值條件下，Aiba模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及擬合結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如表2所示。

從表2可以看出，基于Aiba模型獲得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)rmax具有顯著差異，pH值為8.0 時(shí)，rmax最大，為13.63 g N·(g VSS·d)-1， pH值為7.0 時(shí)的rmax略高于pH值為6.5的。因此，NOB菌屬在pH值為8.0時(shí)具有最高的活性，反應(yīng)速率最快。對(duì)于Aiba模型中KS和KI值，兩者均在pH值為7.0時(shí)最大，分別為0.13 mg·L-1和0.63 mg·L-1，顯著高于pH值為8.0、6.5的。說明基質(zhì)FNA與亞硝酸鹽氧化還原酶的親和力在pH值為7.0時(shí)最小，而在pH值為6.5時(shí)最大。

表2 不同pH值條件下，Aiba模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.2 Kinetic parameters and statistical analysis ofAiba model under different pH values

2.3 pH值對(duì)NOB菌屬亞硝酸鹽氧化還原酶的影響

為了進(jìn)一步探究在大量富集了NOB的系統(tǒng)內(nèi)，pH值變化對(duì)nxrA、nxrB的影響，對(duì)pH值分別為6.5、7.0和8.0條件下的活性污泥進(jìn)行取樣(每個(gè)pH值選3個(gè)平行樣)，采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)nxrA和nxrB基因進(jìn)行定量，nxrA和nxrB基因的拷貝數(shù)如圖3所示。

圖3 不同pH值條件下，nxrA和nxrB基因拷貝數(shù)的變化規(guī)律Fig.3 Changes of nxrA and nxrB genes copy numbers under different pH values

從圖3可以看出，nxrA和nxrB基因的拷貝數(shù)分別介于1.6×109～2.6×109拷貝數(shù)/g濕污泥和3.1×107～4.6×107拷貝數(shù)/g濕污泥之間，并且nxrB基因的拷貝數(shù)比nxrA基因的拷貝數(shù)低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。分析原因在于：nxrA屬于Nitrobacter菌群的功能基因[23]，nxrB為Nitrospira菌群的功能基因[24]，即nxrA和nxrB分別是Nitrobacter和Nitrospira的功能基因指示物；本實(shí)驗(yàn)過程中，Nitrobacter是主導(dǎo)活性污泥系統(tǒng)內(nèi)的最優(yōu)勢(shì)功能菌屬(38.0%)，而Nitrospira的相對(duì)豐度較低(0.26%)；此外，pH值的變化會(huì)對(duì)nxrA和nxrB基因的絕對(duì)豐度造成一定的影響，當(dāng)pH值從6.5增大到7.0時(shí)，nxrA和nxrB基因的絕對(duì)豐度均表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，而當(dāng)pH值從7.0增大到8.0時(shí)，絕對(duì)豐度卻表現(xiàn)出了降低的趨勢(shì)。

眾多研究報(bào)道了pH值是影響NOB菌屬生物活性的重要因素之一，因?yàn)槲⑸飳?duì)環(huán)境的pH值有一定要求，即有最佳生長(zhǎng)環(huán)境[25-27]。這種影響的本質(zhì)應(yīng)體現(xiàn)在活性污泥中的NOB菌屬內(nèi)，nxrA和nxrB基因?qū)Σ煌琾H值的響應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH值能夠顯著影響nxrA和nxrB基因的絕對(duì)豐度，進(jìn)而導(dǎo)致NOB活性的變化。因此，控制適宜的pH 值將有利于生物脫氮系統(tǒng)內(nèi)亞硝酸鹽的積累[28-29]，使NOB的生物活性維持在較高水平。

3 結(jié)論

(1)Nitrobacter是NOB富集系統(tǒng)內(nèi)豐度最高的菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到38.0%，而NOB的其它菌屬如Nitrospira等硝化菌占比均低于0.5%。

(2)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，Haldane、Aiba、Edwards和Luong等4種抑制動(dòng)力學(xué)模型中，Aiba模型最適宜描述FNA對(duì)NOB活性的抑制影響，且表現(xiàn)出“低促高抑”的特征。

(3)熒光定量PCR結(jié)果顯示，nxrA和nxrB基因的絕對(duì)豐度與pH值存在一定關(guān)系，且在pH值為7.0時(shí)，nxrA和nxrB基因拷貝數(shù)最多，分別為2.6×109拷貝數(shù)/g濕污泥和4.6×107拷貝數(shù)/g濕污泥。此外，在大量富集了NOB的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)，nxrA的絕對(duì)豐度高于nxrB，視為主導(dǎo)亞硝酸鹽氧化的功能基因。