2型固有淋巴細胞與兒童1型糖尿病的相關性▲

胡瑩潔

(武漢市第四醫院內分泌科，湖北省武漢市 430033)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一種器官特異性自身免疫性疾病，表現為胰島β細胞破壞或功能衰竭引起的血糖升高，患者需終生依賴胰島素治療維持生命。T1DM多發生于青少年，由于多數T1DM患者發病時年齡偏低、自控能力差，使得血糖控制難度較大，其導致的糖尿病酮癥酸中毒是1型糖尿病兒童最常見的死亡原因之一，因此研究T1DM的防治手段尤為重要[1]。目前認為T1DM的發生是遺傳、免疫、環境等多種因素共同作用的結果，免疫因素可能在T1DM的發展中扮演重要角色并受到越來越多的關注[2]。

人體免疫系統分為固有免疫系統和適應性免疫系統兩大類。固有淋巴細胞(innate lymphoid cell，ILC)是固有免疫系統的重要效應細胞群，廣泛存在于哺乳動物的皮膚、肺、腸道及脂肪組織等防御屏障，具有介導免疫、協助組織修復重建、調節腸道菌群等多種功能[3]。ILC可根據其表達的特定轉錄因子和分泌的細胞因子分為三類，即ILC1、ILC2和ILC3。其中，ILC2主要分布于黏膜組織(肺和腸道)、非淋巴器官(肝、腎和內臟脂肪組織)、淋巴器官(脾、骨髓)及血液，在宿主防御、組織修復及抵抗炎癥性疾病中發揮重要作用[4]。ILC2主要介導Th2類免疫應答，并可以通過多種效應細胞因子調控不同信號通路，參與哮喘、特異性皮炎、嗜酸性胃腸炎等多種免疫性疾病的發生[5]。ILC2作為單獨的細胞亞群，在激活的狀態下可迅速產生Th2細胞相關的細胞因子和其他效應分子，包括白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-5、IL-9、IL-13和表皮生長因子受體配體雙向調節因子，并通過這些細胞因子驅動2型免疫反應的發生[6]。本研究通過分析T1DM患兒與正常兒童ILC2及相關細胞因子的表達差異，初步探討ILC2與T1DM的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2020年1月于武漢市第四醫院住院的20例T1DM患兒為T1DM組。納入標準：(1)年齡8～18歲；(2)符合1999年世界衛生組織制定的1型糖尿病診斷標準[7]。排除標準：(1)2型糖尿病患兒；(2)合并糖尿病急性并發癥，如糖尿病酮癥、酮癥酸中毒、高血糖高滲狀態；(3)患有T1DM以外的其他自身免疫性疾病；(4)有遺傳病家族史。另選取同期來武漢市第四醫院體檢中心體檢的20名健康兒童為正常對照組。納入標準：(1)年齡8～18歲；(2)無糖尿病及糖調節受損；(3)尿糖陰性。排除標準：(1)患有自身免疫性疾病；(2)有遺傳病家族史。本研究經武漢市第四醫院醫學倫理委員會審核通過，研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集一般資料：收集兩組兒童的年齡、性別、血壓。

1.2.2 生化指標檢測：于T1DM組患兒入院時采集其空腹肘靜脈血5 mL，于正常對照組兒童在體檢時采集其空腹肘靜脈血5 mL，采用己糖激酶法檢測空腹血糖及餐后2 h血糖，采用氧化酶法檢測總膽固醇、三酰甘油，采用直接法檢測LDL-C、HDL-C，使用ADVIA 2400全自動生化分析儀(Siemens公司)檢測上述指標，嚴格按照試劑盒(重慶中元生物技術有限公司，批號：H200905、H201109、H201008、H201203、H201106；積水醫療科技有限公司，批號：841RIS)說明書進行檢測。采用高效液相色譜法檢測HbA1c，檢測儀器為伯樂D-10糖化血紅蛋白儀(試劑盒：伯樂實驗室有限公司，批號：64431018)。

1.2.3 外周血單個核細胞的分離：于T1DM組患兒入院時采集其空腹肘靜脈血3 mL，于正常對照組兒童在體檢時采集其空腹肘靜脈血3 mL，經肝素鈉抗凝后，在室溫下1 500 r/min離心10 min。離心結束后將下層細胞沉淀物移至50 mL離心管中，并加入PBS稀釋，用無菌吸管小心吸取白色細胞層置于另一無菌離心管(已事先加入等體積單核細胞分離液)，室溫下2 500 r/min離心25 min，加入適量PBS，1 500 r/min離心10 min，得到的白色沉淀即為外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

1.2.4 流式細胞術檢測PBMC中的ILC2水平：取200 μL PBMC懸液至流式細胞儀上機管，加入5 μL鼠抗人CD45抗體、5 μL鼠抗人CD127抗體、5 μL鼠抗人CD294抗體及人Lineage復合抗體(由CD2、CD3、CD4、CD7等組成)，以上抗體均購自伯樂實驗室有限公司。充分混勻，室溫避光孵育40 min。將Lineage-CD45+CD127+CD294+細胞判定為ILC2，采用流式細胞儀分析ILC2占PBMC的比例。上述實驗設置3個復孔。

1.2.5 ELISA 檢測：于T1DM組患兒入院時采集其空腹肘靜脈血2 mL，于正常對照組兒童在體檢時采集其空腹肘靜脈血2 mL，常溫下3 000 r/min離心20 min，收集上清液。采用 ELISA測定血清IL-4、IL-5和IL-13水平。ELISA試劑盒購于上海恒遠生化試劑有限公司(批號：20200708、20200802、20200907)。

1.3 統計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以例數表示，比較采用χ2檢驗；指標間的相關性采用Pearson檢驗進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料及生化指標的比較 兩組的性別、年齡、收縮壓、舒張壓及總膽固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。與正常對照組相比，T1DM組的空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c水平均升高(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料及生化指標的比較

2.2 兩組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較 與正常對照組比較，T1DM組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均升高(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較(x±s)

2.3 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與一般資料、生化指標及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的相關性分析 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與年齡、收縮壓、舒張壓及總膽固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油水平之間均無相關性(均P>0.05)，但ILC2占PBMC的比例與空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c及血清IL-4、IL-5、IL-13水平之間均呈正相關(均P<0.05)。見表3和表4。

表3 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與一般資料、生化指標的相關性

表4 ILC2占PBMC的比例與血清IL-4、IL-5及IL-13水平的相關性

3 討 論

ILC2是近年來發現的一類重要的ILC亞群，它由骨髓中的淋巴祖細胞在轉錄因子DNA結合抑制劑2、RAR相關孤兒受體α(RAR related orphan receptor alpha,RORα)和GATA結合蛋白3的調控下產生，是小鼠和人類2型免疫反應的中樞調節因子之一[8]。有學者指出，ILC2通過分泌2類細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13來參與宿主防御、組織修復及抵抗炎癥性疾病[9]。目前關于 ILC2在自身免疫性疾病、過敏性疾病中的研究受到越來越多的關注。

ILC主要分布在腸黏膜，可以調節腸道穩態和保護腸黏膜的完整性。Monticelli等[10]的研究表明，ILC2在腸道中發揮屏障保護作用，在腸道受損時，IL-33/雙向調節因子(amphiregulin,AREG)/表皮生長因子受體信號通路可能通過ILC2抑制炎癥和/或促進上皮修復。有研究顯示，IL-33作為一種細胞因子“警報”，可在上皮細胞損傷時激活肺和腸的常駐免疫細胞亞群；IL-33是誘導體內ILC2中AREG表達的有效刺激因子，特別是在腸道中，IL-33 通過誘導腸道中ILC2的表達從而促進AREG的分泌[11]。該研究還顯示，IL-33可誘導不同功能的ILC2群體，同時表達IL-5、IL-13和/或AREG，提示ILC2亞群參與調節腸道表面屏障的炎癥反應[11]。還有學者在惡唑酮誘導的腸道損傷模型中觀察到，IL-25可誘發與疾病嚴重程度相關的IL-13和ILC2的表達，這表明在某些情況下ILC2可能參與腸道損傷時的炎癥反應[12]。

國外有關ILC過度活化后誘導炎癥因子產生而引發自身免疫性疾病的研究，多集中在腸道疾病及皮膚疾病領域。研究顯示，在克羅恩病患者腸道內，ILC1表達升高，ILC1過度活化后通過分泌γ干擾素加重腸道的炎癥水平，而持續的炎癥會引起炎性腸道疾病[13-14]，腸道菌群參與ILC的分化，同時ILC可通過產生不同類型的細胞因子影響腸道菌群組成[15]。還有學者發現，腸道菌群產物芳香烴受體配體和丁酸可以促進胰腺中的ILC分泌IL-23和IL-22，后兩者誘導胰腺分泌細胞表達甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二苷酸結合域蛋白14，如果腸黏膜固有層存在ILC并分泌IL-22，將影響免疫炎癥反應與免疫耐受之間的平衡，推測此機制在腸道炎癥的遷延、復發、擴散中起關鍵作用[15]。此外，Kim等[16]首次發現ILC2 在人及小鼠中均參與了特應性皮炎的發病過程，表面標志為Lineage-CD25+IL-33R+的ILC2在特應性皮炎皮損中聚集，從特應性皮炎皮損區分離得到的ILC2可以表達前列腺素D2受體及CD161，但從正常皮膚分離得到的ILC2并不表達前列腺素D2受體及CD161。

張淡宜等[17]的研究表明，橋本甲狀腺炎患者外周血中IL-5、IL-13水平升高。IL-13被認為是抗炎細胞因子，同時又是強促纖維化因子，其可以表現出不同的生物學功能，最終的效應是促進炎癥消退或者介導病理應答，在哮喘患者中IL-13是介導氣道高反應性和黏膜高分泌的主要介質[18]。有學者通過實時熒光定量PCR檢測發現，橋本甲狀腺炎患者PBMC中RORα、IL-5、IL-13水平均明顯升高，相關性分析顯示RORα和IL-13呈正相關[19]。RORα是調控ILC2的特征性轉錄因子，對維持ILC2分化和功能起到重要作用。進一步對外周血循環中ILC2表達水平與抗體數量的相關性進行分析，發現RORα與抗甲狀腺過氧化物酶抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體呈正相關，IL-5也與抗甲狀腺過氧化物酶抗體呈正相關，IL-13與抗甲狀腺過氧化物酶抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體呈一定的正相關趨勢[19]。這提示ILC2 活性增強可能是橋本甲狀腺炎發病的重要免疫學機制。

通過上述研究可知，ILC2調節機制在自身免疫疾病中具有重要作用，炎癥因子表達升高可促進ILC分化，從而導致自身免疫性疾病的發生，但其具體機制尚存在爭議。本研究結果顯示，T1DM患兒PBMC中的ILC2比例增高，并且T1DM患兒血清IL-4、IL-5、IL-13水平高于健康兒童，且T1DM患兒的ILC2占PBMC的比例與血清IL-4、IL-5、IL-13水平呈正相關(均P<0.05)，提示T1DM患兒存在體內ILC2增加，且炎癥反應增強，ILC2可能通過與炎癥因子相互作用，在T1DM發病過程中起到關鍵作用。本研究行進一步相關性分析，結果顯示，T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c水平均呈正相關(均P<0.05)，提示ILC2可能參與T1DM的病情進展。

綜上所述，T1DM患兒體內ILC2增加，其與患兒的血糖控制水平及炎病水平呈正相關，ILC2可能通過與炎癥因子相互作用，參與T1DM的發生和發展，ILC2有可能成為T1DM潛在的治療靶點。但由于本研究臨床樣本量小，未涉及具體作用機制的研究。今后可通過動物實驗來進一步明確ILC2與Th2類細胞因子之間的上下游關系，從而闡明ILC2參與T1DM發病的分子機制。