分子生物學(xué)技術(shù)在綿羊毛、山羊絨鑒別中研究應(yīng)用進(jìn)展

費(fèi)靜 陳曉 劉敏華 葛存卿 秦皓

摘 要：山羊絨、綿羊毛外觀相似，理化性質(zhì)相近，這是傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法客觀區(qū)分兩者最主要的原因。為從根本上解決這個(gè)問(wèn)題， 科研人員從生命最本質(zhì)的特征入手，開發(fā)了針對(duì)特種動(dòng)物纖維角蛋白檢測(cè)方法，以及毛髓細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)DNA的檢測(cè)方法。文章簡(jiǎn)述了檢測(cè)的基本原理、發(fā)展歷程、應(yīng)用范圍及存在的問(wèn)題，對(duì)目前存在的幾種分子生物學(xué)檢測(cè)方法作了較為系統(tǒng)的比較分析。其中，DNA檢測(cè)靈敏度高，但使用范圍受限;蛋白檢測(cè)方法較為穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)多種混合物的定性檢測(cè)，但靈敏度不及DNA檢測(cè)法。總之，分子生物學(xué)檢測(cè)法是傳統(tǒng)檢測(cè)法的有益補(bǔ)充，在其適用范圍內(nèi)，可以提供客觀一致的檢測(cè)結(jié)果。

關(guān)鍵詞：羊絨;羊毛;DNA;蛋白質(zhì);鑒別

中圖分類號(hào)：TS137

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1009-265X（2022）01-0036-05

Abstract： Similarity between cashmere and sheep wool in appearance， physical and chemical properties are two main reasons why traditional detection methods can't distinguish them objectively. To solve this problem fundamentally， starting from the most essential characteristics of life， researchers developed a new detection method for fibrokeratin of special animals and a detection method for the genetic material DNA in medullary cells. This review provides a systematic comparative analysis of several existing molecular biological detection methods， and focuses on the basic principle， development history， application scope and existing problems of these methods. Among them， DNA detection features a high sensitivity， but a limited applicable scope. While protein analysis is more stable， and easy to achieve qualitative detection of a variety of mixtures， but its sensitivity is not as good as that of DNA detection. In conclusion， molecular biological detection methods are a good supplement to traditional methods and can provide objective and consistent results within their scope of application.

Key words： cashmere; wool; DNA; protein; identification

山羊絨因其纖細(xì)、柔軟、保暖的特點(diǎn)，長(zhǎng)期占據(jù)著高檔面料原料榜首。物以稀為貴，憑借其優(yōu)異的性能和產(chǎn)量的稀缺性，山羊絨價(jià)格較高，利欲熏心的不法分子在山羊絨中摻入價(jià)格較低的其他纖維，如羊毛、牦牛絨等，以次充好，牟取暴利，侵害了消費(fèi)者的權(quán)益[1]。美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)均制定了相應(yīng)的標(biāo)簽法規(guī)，打擊以次充好，維護(hù)市場(chǎng)的公平公正。中國(guó)是山羊絨的主要出口國(guó)，這種欺詐行為，也有損中國(guó)羊絨生產(chǎn)大國(guó)的形象。這就對(duì)檢測(cè)監(jiān)管部門提出了更高的要求。過(guò)去傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，主要從山羊絨和綿羊毛的外觀形態(tài)入手，借助顯微鏡、電鏡等放大成像設(shè)備進(jìn)行鑒別[2]。纖維的染色及其他復(fù)雜的加工工藝掩蓋了鱗片厚度形態(tài)等鑒別指標(biāo)，此外改性綿羊毛、拉伸羊毛、剝鱗羊毛等的摻入，進(jìn)一步增加了檢測(cè)難度。這類基于外觀形態(tài)的檢測(cè)方法，準(zhǔn)確度受限于檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)果較為主觀[3-4]。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，以深度學(xué)習(xí)為代表的視覺(jué)成像識(shí)別技術(shù)也取得了突破性進(jìn)展，研究人員建立了以AI為基礎(chǔ)，結(jié)合自動(dòng)圖像處理技術(shù)的纖維鑒別檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)羊毛、羊絨的自動(dòng)化、智能化檢測(cè)。這一方法的特點(diǎn)在于重復(fù)性好，檢測(cè)效率高，但方法的準(zhǔn)確度有賴于譜圖庫(kù)的不斷完善。

人們對(duì)生物體的認(rèn)知隨著生命科學(xué)的發(fā)展已逐漸深入到微觀水平。山羊絨是山羊身上隱藏于粗毛根部的底絨，而羊毛則來(lái)自綿羊，山羊（Capra hircus）和綿羊（Ovis aries）在動(dòng)物學(xué)分類上同科不同屬。既然如此，它們?cè)诜肿訉用嬉欢ù嬖谥锓N特異的可區(qū)分的特征。

1 脫氧核糖核酸（DNA）水平

1.1 檢測(cè)原理

DNA即脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid），是染色體主要組成成分，同時(shí)也是主要遺傳物質(zhì)。每個(gè)單核苷酸又由3種比較簡(jiǎn)單的化合物即磷酸、脫氧核糖和堿基各一分子組成。堿基有嘌呤和嘧啶兩大類，嘌呤中主要有腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G），嘧啶中主要有胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。單個(gè)脫氧核糖核酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接形成長(zhǎng)鏈。DNA檢測(cè)的依據(jù)是物種特異的核糖核苷酸組成排列，具有客觀、精確的特點(diǎn)，近年來(lái)在司法鑒定、動(dòng)植物檢疫、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。檢測(cè)的基礎(chǔ)是PCR技術(shù)。PCR技術(shù)是一種體外模擬DNA擴(kuò)增的技術(shù)，短時(shí)間內(nèi)能將微量的DNA大量增加。從毛發(fā)中獲得足夠量，且比較完整能進(jìn)行PCR擴(kuò)增的DNA成了制約該技術(shù)發(fā)展的一個(gè)瓶頸。毛發(fā)DNA種屬鑒別長(zhǎng)時(shí)間停滯不前，是由于過(guò)去的研究集中在細(xì)胞基因組DNA上，而基因組DNA大量集中于帶毛囊的動(dòng)物纖維中，在毛干中的含量極少，一旦纖維經(jīng)過(guò)染整后就難檢測(cè)到了。直到2004年印度科學(xué)家Subramanian等[5]將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到線粒體DNA上，大大推進(jìn)了這項(xiàng)技術(shù)在特種動(dòng)物纖維鑒別中的研究應(yīng)用。

1.2 定性檢測(cè)

美國(guó)科學(xué)家hamalyn等[6]對(duì)DNA分析定性檢測(cè)特種動(dòng)物纖維做了最早的嘗試。1992年，他們利用探針雜交技術(shù)，設(shè)計(jì)了特異性結(jié)合綿羊DNA的綿羊探針，從而可以區(qū)分羊毛與羊絨、馬海毛等其他纖維，但受限于當(dāng)時(shí)生物技術(shù)水平，仍存在諸多缺點(diǎn)，無(wú)法推廣。線粒體DNA廣泛存在于皮質(zhì)細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞中存在多個(gè)拷貝，相較基因組DNA更容易得到。kerkhoff等[3]于2009年實(shí)現(xiàn)了物種特異性PCR區(qū)分鑒別羊毛、羊絨、駱駝毛、牦牛毛等纖維，實(shí)現(xiàn)了快速簡(jiǎn)便的纖維定性分析，但同樣存在著無(wú)法精確定量分析混合纖維的問(wèn)題。

ISO18074：2015《紡織品 DNA分析法鑒別某些特種動(dòng)物纖維 山羊絨、綿羊毛、牦牛絨及其混合物》通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)山羊絨、綿羊毛、牦牛絨的線粒體DNA的物種特異性引物，對(duì)經(jīng)抽提純化的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)特定長(zhǎng)度片段的電泳遷移來(lái)確認(rèn)動(dòng)物纖維的種類[7]。該方法實(shí)現(xiàn)了山羊絨、綿羊毛、牦牛絨的定性鑒別。該標(biāo)準(zhǔn)是首個(gè)利用DNA檢測(cè)進(jìn)行動(dòng)物纖維鑒別的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 定量檢測(cè)

熒光定量PCR是PCR技術(shù)的升級(jí)，可通過(guò)熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA擴(kuò)增的監(jiān)控，不僅能對(duì)物種進(jìn)行定性，還能進(jìn)行定量。

課題組研究利用了TaqMan熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了山羊絨、綿羊毛的定量檢測(cè)。針對(duì)山羊絨、綿羊毛種內(nèi)保守，種間差異的線粒體DNA區(qū)段設(shè)計(jì)了特異性的引物探針，通過(guò)使用已知含量的標(biāo)準(zhǔn)混合物建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)未知樣品的檢測(cè)。收集不同產(chǎn)地、年齡段的山羊絨進(jìn)行方法的驗(yàn)證，證明了線粒體DNA的數(shù)目在動(dòng)物毛發(fā)中是相對(duì)穩(wěn)定的，該定量方法具有普適性[4]。熒光定量PCR法與普通PCR相比，是閉管檢測(cè)，減少了污染因素，且能實(shí)現(xiàn)山羊絨、綿羊毛相對(duì)定量檢測(cè)，是一個(gè)質(zhì)的飛躍。

GB/T 36433-2018《紡織品 山羊絨和綿羊毛的混合物DNA定量分析 熒光PCR法》就是該研究的應(yīng)用。靈敏度高，重復(fù)性好，可檢測(cè)到1%的甚至更低的異質(zhì)纖維摻入[8]。該定量方法是一種相對(duì)定量檢測(cè)，對(duì)相同組成的山羊絨、綿羊毛混合物，經(jīng)過(guò)同樣的染色、后整理等處理，均能得到一致的含量檢測(cè)結(jié)果[9]。

1.4 存在的問(wèn)題

DNA檢測(cè)的適用范圍有一定的限制。完整的一定量的DNA是進(jìn)行PCR檢測(cè)的必要條件。對(duì)于某些過(guò)度處理，尤其經(jīng)氧化剝色的纖維定量結(jié)果不準(zhǔn)確，原因是DNA鏈不耐受強(qiáng)氧化劑，鏈斷裂后PCR反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。另外，山羊絨回用纖維常因多次染色，其處理程度與相混合的綿羊毛不一致，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。因而GB/T 36433-2018對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍作了嚴(yán)格的限制。

2 蛋白水平的檢測(cè)

2.1 檢測(cè)原理

角蛋白是毛發(fā)纖維的重要組成部分[10]，DNA中存在物種差異，也會(huì)反映到表達(dá)的蛋白中。角蛋白是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，由于角蛋白含有較多的胱氨酸，故二硫鍵含量特別多，在蛋白質(zhì)肽鏈中起交聯(lián)作用，因此角蛋白化學(xué)性質(zhì)特別穩(wěn)定，有較高的機(jī)械強(qiáng)度。由于蛋白的分子量比較大，需要溫和地將角蛋白溶解下來(lái)，通過(guò)一定的分離，找到山羊絨和綿羊毛存在物種差異的角蛋白區(qū)域，對(duì)存在物種差異的多肽片段進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 定性定量檢測(cè)

意大利科研人員率先進(jìn)行了蛋白免疫反應(yīng)鑒別山羊絨和綿羊毛的大膽嘗試，使用免疫小鼠產(chǎn)生的抗山羊的單克隆抗體進(jìn)行山羊絨和綿羊毛的鑒別分析，該方法可以實(shí)現(xiàn)定性鑒別和粗略的定量檢測(cè)，但受限制于蛋白提取的產(chǎn)率和重復(fù)性，以及免疫檢測(cè)步驟的繁瑣性，未大面積推廣[11]。Sara等[12]在前人的基礎(chǔ)上，開發(fā)了儀器檢測(cè)蛋白指紋圖譜鑒別特種動(dòng)物纖維的方法。該方法采用了液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜 （LC-ESI-MS）作為檢測(cè)手段，兼具了液相色譜儀有效分離及質(zhì)譜儀強(qiáng)大的組分鑒定能力。Claudia等[13]通過(guò)一系列不同產(chǎn)地來(lái)源的動(dòng)物纖維驗(yàn)證了該方法的普適性。張娟等[14-15]使用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)羊毛羊絨鑒別的可能性開展了研究，找到了多個(gè)物種特異性的山羊絨，綿羊毛、綿羊絨的多肽片段，實(shí)現(xiàn)了定性檢測(cè)，為后續(xù)定量方法的開發(fā)提供了依據(jù)。

激光解吸基質(zhì)輔助飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是另一種檢測(cè)多肽的有效手段。這種新型的軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)，已經(jīng)在蛋白質(zhì)、多肽、核酸、寡糖等生物大分子質(zhì)量測(cè)定上得到了廣泛應(yīng)用，具有靈敏度高，準(zhǔn)確度高，高通量，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[16]。張娟[15]考察了尿素、二硫蘇糖醇和碘乙酰胺的濃度及溫度對(duì)溶解提取動(dòng)物纖維角蛋白的影響，用MALDI-TOF-MS對(duì)蛋白進(jìn)行測(cè)定，在一定掃描范圍內(nèi)找到物種特異性的質(zhì)核比，建立了鑒別山羊絨、綿羊毛的方法，并通過(guò)脫磷、拉伸等羊毛的驗(yàn)證，確認(rèn)方法的可靠、客觀性。Kim等[17]用MALDI-TOF-MS分析了25個(gè)不同品種來(lái)源的山羊絨樣品和7個(gè)牦牛絨樣品的多肽片段，找到了物種特異的質(zhì)核比作為定性鑒別的標(biāo)記，并通過(guò)一系列實(shí)際樣品的檢測(cè)驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性。

ISO 20418提供了兩種多肽分析定性定量檢測(cè)特種動(dòng)物纖維的方法。ISO 20418-1：2018利用液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜 （LC-ESI-MS）對(duì)特種動(dòng)物角蛋白多肽進(jìn)行分離檢測(cè)，而ISO 20418-2：2018利用的是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行多肽的定性定量檢測(cè)。兩種方法均選擇了2691、2664分別作為山羊絨，綿羊毛的特征標(biāo)記。根據(jù)山羊絨、綿羊毛的特征標(biāo)記（峰）進(jìn)行定性。通過(guò)對(duì)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)混合物進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)其特征峰面積或峰高，建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣品的定量檢測(cè)。

這兩種方法均需要對(duì)溶解的角蛋白進(jìn)行胰蛋白酶處理，使之酶解成更易檢測(cè)的多肽片段。通過(guò)對(duì)物種特性多肽短片大小的測(cè)定實(shí)現(xiàn)纖維的定性鑒別。不同的是第一種方法對(duì)所有的蛋白均進(jìn)行了酶解處理，然后再進(jìn)行分離檢測(cè)，而第二種方法先使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，回收特定的蛋白片段后再對(duì)其進(jìn)行胰酶處理[18-19]。其余方法上的差異見表1。

兩個(gè)方法的定量均需要利用已知含量的混合標(biāo)樣建定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立起含量和物種特征的面積比之間的聯(lián)系，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。對(duì)MALDI-TOF-MS多肽分析法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，該定量方法對(duì)不同品種、不同產(chǎn)地的山羊絨均適用。剝鱗處理，拉伸處理均對(duì)其結(jié)果無(wú)影響，但該方法檢測(cè)剝色紫絨混合樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，山羊絨檢測(cè)含量偏低，推測(cè)剝色氧化劑對(duì)多肽結(jié)構(gòu)有破壞作用[20]。

2.3 存在的問(wèn)題

蛋白多肽定性定量測(cè)定法，可輕松用于多種混合動(dòng)物纖維的定性鑒別，特別適用于多種動(dòng)物纖維混合物的定性鑒別。只要知道特征標(biāo)記，即可識(shí)別其存在。若構(gòu)建合適的定量模型后，也可用于3種甚至更多混合纖維的定量。但該方法的靈敏度不夠高，混合低值僅能測(cè)到5%左右[19]。此外，該方法對(duì)氧化剝色的產(chǎn)品也不適用。

3 結(jié) 語(yǔ)

回顧了特種動(dòng)物纖維分子生物學(xué)水平定性定量的研究歷程和最新進(jìn)展，對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了比較分析。總的來(lái)說(shuō)，DNA檢測(cè)儀器設(shè)備投入低，相對(duì)比較成熟，靈敏度高，但適用的范圍受限更多一些;蛋白檢測(cè)適用范圍廣，但靈敏度不高，低含量樣品無(wú)法檢測(cè)。這些方法的開發(fā)和應(yīng)用，是對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的有益補(bǔ)充，實(shí)現(xiàn)了儀器檢測(cè)，減少了主觀因素的影響，對(duì)毛紡產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)、消費(fèi)者合法權(quán)益的維護(hù)有重要意義。特種動(dòng)物纖維的檢測(cè)，尤以羊毛羊絨為代表在定量檢測(cè)，到目前為止還是纖維成分鑒別的難題。綜合運(yùn)用顯微鏡法和分子生物學(xué)檢測(cè)法，能得到相對(duì)準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

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