牙齦卟啉單胞菌上調鈣結合蛋白1促進牙齦上皮細胞增殖

張雨薇 何雨軒 丁一 劉程程

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院牙周病科，成都610041

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）約占口腔癌的90%[1]。吸煙、酒精和病毒感染（如人乳頭瘤病毒）是OSCC的獨立危險因素[2-3]，但仍有15%的病例病因不明[4]。近年來，牙周致病菌被認定為OSCC的一個獨立危險因素[3]。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周關鍵致病菌。Katz等[5]研究發現，P.gingivalis在口腔鱗狀細胞癌組織中的檢出量顯著高于正常牙齦組織。P.gingivalis能夠促進牙齦上皮細胞增殖，抑制凋亡，并誘導上皮—間充質轉化，促進腫瘤的發生、發展[6]。細胞增殖是細胞通過分裂，使細胞數目增多，并將遺傳信息傳給子代細胞，細胞過度增殖則會導致惡性腫瘤。因此，探究P.gingivalis促進牙齦上皮細胞增殖的機制具有重要意義。

鈣結合蛋白1（calbindin 1，CALB1）和鈣結合蛋白2（calbindin 2，CALB2）同是EF-手型家族的鈣結合蛋白[7]。CALB1在谷氨酸受體激活后可調節鈣離子內流，在正常骨細胞、成骨細胞和多巴胺能神經元[8-10]以及骨肉瘤細胞U2OS、非小細胞肺癌細胞和卵巢癌細胞等腫瘤細胞[11-13]中抑制多種促凋亡信號通路誘導的細胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用，常用于測定細胞凋亡[14]。CALB1能夠調節腫瘤抑制蛋白p53。在卵巢癌細胞中，CALB1可作用MDM2，促進p53與MDM2的相互作用，導致p53蛋白降解[12]。p53蛋白水平及其轉錄活性受到MDM2調控，而MDM2的基因表達受到p53調控，形成負反饋通路[15]。目前P.gingivalis對CALB1表達的影響尚無報道。CALB2首次在視網膜中被發現，由視網膜神經節細胞亞群、暗斑和水平細胞表達[16]。CALB2在皮膚表皮細胞和皮膚腺上皮表達，并受到甲狀腺激素紊亂的顯著影響[17]。成人Malassez上皮亞群中也有表達，是成釉細胞瘤上皮、子宮內膜間質細胞和間皮細胞標志物[18-21]。本研究用CA9-22細胞體外模擬牙齦上皮細胞，探究P.gingivalis感染對CA9-22中CALB1表達的影響，以及CALB1在P.gingivalis影響細胞增殖和細胞凋亡中的作用，并初步探討其相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

P.gingivalisATCC 33277、P.gingivalisW83、戈登鏈球菌（Streptococcus gordonii,S.gordonii）DL1由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。CA9-22細胞株購買自商城北納創聯生物科技有限公司。胰蛋白胨大豆肉湯培養基、腦心浸液培養基、高容量逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑、Taqman探針（Thermo Fisher Scientific公司，美國），DMEM培養基、胎牛血清（Gibco公司，美國），CALB1抗體、MDM2抗體、p53抗體、GAPDH抗體（CST公司，美國），Trizol（Invitrogen公司，美國），RNAeasy plus試劑盒（Qiagen公司，德國），LipoJet轉染試劑（SignaGen公司，美國），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）細胞增殖酶聯免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Ab‐cam公司，英國），細胞凋亡熒光底物（EnzChek公司，美國），RIPA緩沖液（Roche公司，美國），BCA蛋白定量試劑盒、電化學發光試劑（Invitro‐gen公司，美國）。

1.2 實驗設計及分組

1）探究P.gingivalis感染對CA9-22細胞CAL-B1表達的影響。①P.gingivalis感染對CA9-22細胞CALB1、CALB2 mRNA表達的影響。實驗分為未感染組、P.gingivalisATCC 33277感染組、P.gingivalisW83感染組、S.gordoniiDL1感染組，采用qPCR法檢測CALB1、CALB2 mRNA表達。②P.gingivalis感染對CA9-22細胞CALB1蛋白表達的影響。實驗分為對照組和P.gingivalisATCC 33277感染組[包括感染復數（multiplicity of infection，MOI）10、50、100三亞組]，采用免疫印跡法檢測CALB1蛋白表達。③大腸桿菌LPS對CA9-22細胞CALB1表達的影響，實驗分為未處理組和大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理組，采用qPCR法檢測CALB1 mRNA表達。

2）探究CALB1基因對P.gingivalisATCC 33277感染時CA9-22細胞增殖和凋亡的影響。細胞增殖實驗分為未感染siRNA-Con組（未感染+siRNA沉默空白基因）、P.gingivalis感染siRNA-Con組（P.gingivalis感染+siRNA沉默空白基因）、未感染si-RNA-CALB1組（未感染+siRNA沉默CALB1基因）、P.gingivalis感染siRNA-CALB1組（P.gingivalis感染+siRNA沉默CALB1基因），采用BrdU進行細胞增殖分析。細胞凋亡實驗時分為未感染組、P.gingivalis感染組、P.gingivalis感染siRNA-Con組、P.gingivalis感染siRNA-CALB1組，采用Cas‐pase-3活性測定法分析細胞凋亡情況。

3）探究CALB1基因對MDM2和p53蛋白表達的影響。實驗分為未感染siRNA-Con組、P.gingivalis感染siRNA-Con組、未感染siRNA-CALB1組、P.gingivalis感染siRNA-CALB1組，其中P.gingivalis感染組中均為P.gingivalisATCC 33277感染。采用免疫印跡法檢測MDM2、p53蛋白表達。

1.3 細菌和細胞培養

P.gingivalis培養在胰蛋白胨大豆肉湯培養基補充酵母提取物（1 mg·mL-1）、氯高鐵血紅素（5μg·mL-1）和維生素K（1μg·mL-1）中，37℃厭氧培養；S.gordonii培養在腦心浸液培養基中，37℃厭氧培養。

使用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM培養基，將CA9-22細胞培養于5%CO2、37℃恒溫條件下。隔日換液，2～3 d后使用胰蛋白酶消化貼壁細胞，DMEM終止消化并離心后，重懸接種于培養皿中進行細胞傳代。

將細胞培養至約80%時，采用MOI 10、50、100的細菌刺激1 h，然后更換新鮮DMEM培養基繼續培養23 h，收集細胞用于實驗[22]。

1.4 qPCR

Trizol法提取細胞總RNA后，進一步采用RNAeasy plus試劑盒純化RNA。使用高容量逆轉錄試劑盒將RNA（2μg）反轉錄為cDNA后進行qPCR。將加好樣品的96孔板放在ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀進行反應。引物序列：CALB1上游5’-ATGGCAGAATCCCACCTGCA-3’，下游5’-CTAGTTATCCCCAGCACAGAG-3’；CALB2上游5’-CCTGCACCTGGCCGAGCTGACG-3’，下游5’-GCTGGAGCCCACGTGCTGCCTG-3’；GAPDH上游5’-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，下游5’-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3’。設置PCR循環條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃15 s，共40個循環。自動計算閾值，每個反應體系中熒光信號達到設定閾值經歷的循環數為循環閾值（Ct）。使用2ΔΔCt法對CALB1和CALB2基因的表達進行相對定量分析。

1.5 RNA干擾

細胞生長到約60%時，通過Lipojet轉染試劑將siRNA轉染至CA9-22細胞，轉染24 h后，更換細胞培養基并加入細菌刺激24 h。收集細胞，qPCR檢測目標基因敲除情況。

1.6 免疫印跡法

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液冰上充分裂解細胞，低溫離心后取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。配置12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳轉膜后，使用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉1 h后，分別加入CALB1、MDM2、p53及GAPDH兔抗人一抗，4℃過夜。TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h再次TBST洗膜3次，電化學發光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色。

1.7 免疫熒光法

CA9-22細胞在腔室載玻片上生長至60%時，采用P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）刺激細胞24 h，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，4%多聚甲醛固定，Triton X-100通透后，使用2%BSA封閉45 min，加入CALB1兔抗人一抗孵育1 h，洗滌后將樣本分別與Alexa Fluor 488標記的羊抗兔二抗和Texas Red?-X鬼筆環肽共孵育1 h，最后使用含DAPI染料的中性樹脂封片。通過Leica SP8共聚焦顯微鏡對樣本進行掃描，并采集圖像。

1.8 BrdU細胞增殖分析

在P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）感染結束前2 h，用10μmol·L-1BrdU標記CA9-22細胞。磷酸鹽緩沖液清洗2次后用70%乙醇固定細胞30 min，磷酸鹽緩沖液再次清洗后進行染色。用過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG孵育細胞30 min，磷酸鹽緩沖液清洗后用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺過氧化物酶底物室溫避光孵育30 min。加入終止液，檢測OD450nm。

1.9 Caspase-3活性測定

將1μg·mL-1喜樹堿（camptothecin，CAM）加入CA9-22細胞培養液中誘導細胞凋亡4 h。P.gingivalis感染組加入P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）培養24 h，收集、裂解細胞后，通過Enz-Chek Caspase-3分析試劑盒檢測Caspase-3活性。

1.10 統計學分析

采用GraphPad Prism V8軟件對數據進行ANOVA和Tukey多重比較檢驗。

2 結果

2.1 P.gingivalis感染促進CA9-22細胞CALB1的表達

qPCR實驗結果顯示，與未感染組相比，P.gingivalisATCC 33277感染組和P.gingivalisW83感染組CA9-22細胞中CALB1表達升高，差異有統計學意義（P<0.05）；S.gordoniiDL1感染組CALB1表達無明顯變化。與未感染組相比，P.gingivalis感染組和S.gordonii感染組CA9-22細胞中CALB2表達均無明顯變化（圖1A）。與未處理組相比，大腸桿菌LPS處理組CA9-22細胞中CALB1表達升高（圖1B）。

圖1 qPCR檢測CA9-22細胞中CALB1和CALB2的表達Fig 1 Detecting the expression of CALB1 and CALB2 in CA9-22 cells by qPCR

免疫印跡法檢測CA9-22細胞中CALB1蛋白表達結果顯示，與對照組相比，P.gingivalisATCC 33277感染組CA9-22細胞中CALB1表達升高，各條帶呈MOI依賴性（圖2A、B）。免疫熒光檢測顯示，P.gingivalisATCC 33277感染組中CALB1蛋白熒光較對照組更明顯（圖2C）。

圖2 CA9-22細胞中CALB1蛋白表達Fig 2 Expressionsof CALB1 in CA9-22 cells

2.2 CALB1影響P.gingivalis誘導的CA9-22細胞增殖

BrdU實驗結果見圖3A。與未感染siRNA-Con組相比，P.gingivalis感染siRNA-Con組的吸光度值增加；與未感染siRNA-CALB1組相比，P.gin-givalis感染siRNA-Con組的吸光度值無明顯變化?？梢?，P.gingivalisATCC 33277感染促進了CA9-22細胞增殖，而降低CALB1的表達后可抑制P.gingivalisATCC 33277對CA9-22細胞增殖的促進作用。

圖3 CALB1基因對P.gingivalis感染時CA9-22細胞增殖和凋亡的影響Fig 3 The effects of CALB1 on proliferation and apoptosis of CA9-22 infected with P.gingivalis

細胞凋亡實驗結果見圖3B。與未感染組相比，P.gingivalis感染組，P.gingivalis感染siRNA-Con組和P.gingivalis感染siRNA-CALB1組中CA9-22細胞Caspase 3活性均明顯降低（P<0.00 1）；與P.gingivalis感染siRNA-Con組相比，P.gingivalis感染siRNA-CALB1組CA9-22細胞Caspase 3活性無明顯變化。可見，下調CALB1表達不影響P.gingivalis感染對CA9-22凋亡的抑制作用。

2.3 CALB1通過MDM2-p53途徑調控細胞增殖

免疫印跡法和蛋白表達定量分析檢測結果見圖4。與未感染組相比，P.gingivalis感染后CA9-22細胞MDM2表達升高，p53表達降低。與P.gingivalis感染siRNA-Con組相比，P.gingivalis感染siRNA-CALB1組CA9-22細胞MDM2表達降低，p53表達升高。

圖4 CALB1對CA9-22細胞中MDM2和p53表達的影響Fig 4 Theeffectsof CALB1 on the expression of MDM2 and p53 in CA9-22

3 討論

P.gingivalis是牙周關鍵致病菌，可內化于上皮細胞，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，誘導上皮—間充質轉化，引發細胞異常遷移，被認為是P.gingivalis引起上皮細胞功能紊亂的重要原因[6]。鈣結合蛋白是一種對鈣離子有高度親和性的蛋白質，通過鈣離子信號傳導，調控細胞活動[23]。本課題從qPCR、免疫印跡、免疫熒光和RNA干擾等多個角度進行研究，結果表明P.gingivalis感染可導致CA9-22細胞CALB1表達顯著增加，而降低CALB1的表達，可以顯著抑制P.gingivalis誘導的細胞增殖，其機制可能與MDM2-p53途徑有關。

鈣結合蛋白作為細胞第二信使系統的重要成分，參與調控細胞增殖和細胞凋亡等多種細胞活動。研究[13]表明，CALB1表達下調后，骨肉瘤U2OS細胞增殖被顯著抑制，細胞凋亡被促進。本研究發現，P.gingivalis感染對CA9-22細胞中CALB2的表達無顯著影響，但可導致CALB1表達顯著上調，并促進細胞增殖。降低CALB1表達會顯著抑制P.gingivalis誘導的細胞增殖。這表明CALB1在P.gingivalis促進CA9-22細胞增殖過程中發揮重要作用。在細胞凋亡方面，本研究發現，P.gingivalis可以抑制CAM誘導的CA9-22凋亡，但下調CALB1表達對CA9-22細胞凋亡無顯著影響，這提示P.gingivalis對CA9-22細胞凋亡的抑制作用不依賴于CALB1。

腫瘤抑制蛋白p53參與細胞增殖、代謝、衰老和凋亡等過程的大量基因的主轉錄調節因子，在預防細胞惡變中發揮重要作用。P.gingivalis的LPS可異常調節p53，并通過影響其下游炎性基因的表達，促進細胞增殖[24]。P.gingivalis的FimA菌毛蛋白可以降低p53水平，加速原代牙齦上皮細胞的細胞周期進展，促進細胞增殖[25]。p53的穩定性和活性受CHK2、Aurora A、CK1δ、CK1ε等激酶的影響。在P.gingivalis感染的牙齦上皮細胞中，這些激酶被抑制，進而影響P53的活性[26-27]。由此可見，P.gingivalis可以通過調節p53促進細胞增殖。MDM2不僅可與p53的反式激活結構域結合抑制p53[28]，也可以通過E3泛素連接酶的作用，將p53經泛素途徑降解[12]。Cao等[12]通過蛋白質體外結合實驗研究發現，在卵巢癌細胞中，CALB1可與內源性MDM2結合，促進MDM2和p53的相互作用，抑制p53。本研究免疫印跡法結果顯示，P.gingivalis感染的CA9-22細胞中MDM2表達升高而p53表達降低；當降低CALB1表達后，MDM2表達降低，而p53表達升高，表明P.gingivalis感染促進CALB1表達，CALB1可能作為輔助激活因子通過影響MDM2-p53進而促進CA9-22細胞增殖。

綜上所述，P.gingivalis可以通過上調CALB1的表達誘導CA9-22細胞增殖，其機制可能與MDM2-p53通路有關。本研究結果為P.gingivalis促進上皮功能紊亂機制的研究提供了新的靶點和思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。