間歇浸沒植物生物反應器培養梔子愈傷組織及產藏紅花素條件研究

金磊磊 李澤坤 金慧 朱星揚 張保錢 蔣海俠 陳集雙

摘要：為建立梔子愈傷組織的間隙浸沒植物生物反應器高通量培養體系，同時探討誘導劑對梔子愈傷組織中藏紅花素合成的影響。以MS+2.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L 萘乙酸（NAA）+30 g/L蔗糖為增殖培養基，在40 d的培養時期內，梔子愈傷組織在植物生物反應器中生長狀況良好，增殖系數呈升高趨勢。對不同培養時間（20、30、40 d）和添加誘導劑處理的梔子愈傷組織中的藏紅花素含量進行檢測，結果表明，隨著培養時間的增加，梔子愈傷組織中的藏紅花素含量顯著提高，在培養40 d時達到了0.206 5 mg/g;添加CuSO4和茉莉酸甲酯（MeJA）促進了梔子愈傷組織中藏紅花素的合成，單位質量梔子愈傷中的藏紅花素含量顯著增加，培養30 d時達到0.372 3 mg/g。

關鍵詞：梔子;愈傷組織;藏紅花素;植物生物反應器;誘導劑

中圖分類號：S567.04 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0042-05

收稿日期：2021-05-16

基金項目：江蘇先進生物與化學制造協同創新中心項目（編號：XTD1825）;國家自然科學基金（編號：31560079）。

作者簡介：金磊磊（1987—），男，浙江東陽人，碩士，實驗師，從事植物細胞工程、藥用植物天然產物開發方面的研究。 E-mail：jinleilei2011@163.com。

通信作者：陳集雙，博士，教授，博士生導師，從事生物資源學研究。E-mail：biochenjs@njtech.edu.cn。

梔子（Gardenia jasminoides Ellis.），別稱黃梔子、山梔子、林蘭等，屬于茜草科梔子類植物，梔子花是衛生部頒布的第1批藥食兩用資源。梔子作為傳統中藥，具有護肝、利膽、降壓、鎮靜、止血、消腫等作用[1]。梔子含有黃酮類、有機酸酯類、多糖類、醛類、醇類、長鏈烷烴類等化合物成分，其中梔子果實中主要的有效成分為藏紅花素（crocin）、藏紅花酸和梔子苷[2]。藏紅花素又名西紅花苷，主要來源于藏紅花的成熟花絲中，是藏紅花的有色成分且是主要成分[3]。研究表明，藏紅花素具有降血脂、抗腫瘤等功效。由于藏紅花以柱頭入藥，且藏紅花適宜種植區域有限，高品質的藏紅花資源短缺，年產量極低。梔子繁殖以扦插和實生苗種植為主，現有資源量大，可作為制備藏紅花素的植物資源。

不同品種和產地梔子果中藏紅花含量不同，目前報道的梔子果中藏紅花素含量均在1%以內[4-8]。石鳳鳴等發現隨著梔子果實的成熟，藏紅花素的含量顯著增加[9]。付小梅等通過研究發現，藏紅花素在pH值為6.0～7.0之間最穩定并且光照、溫度均能影響其穩定性[10]。陳雁等利用高效液相色譜（HPLC）法測定了不同產地梔子中的藏紅花素含量，其中江西吉安的梔子果實的藏紅花素含量最高，達到了0.68%[11]。據研究報道，梔子的愈傷組織中也存在微量的藏紅花素。陳書安等對產藏紅花素的梔子愈傷組織進行了誘導和篩選，從而篩選出產藏紅花素的梔子細胞系，其中1個細胞系的藏紅花素含量達0.348 mg/g[12]。

筆者所在課題組自主開發了用于植物高通量繁育的間歇浸沒式植物生物反應器，前期研究表明，該系統有利于帶塊莖（鱗莖）的植物繁殖體、植物愈傷組織、蘭科植物原球莖等的增殖擴繁，在白芨、半夏、金釵石斛等藥用植物種苗和組織器官的繁育上取得了較好的應用效果[13-15]。本研究基于植物生物反應器培養系統，以期建立梔子愈傷的高通量增殖體系，并探索通過植物生物反應器持續生產梔子愈傷、產藏紅花素的優化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年4月，選取固體組培瓶中培養30 d 的山梔子愈傷組織作為增殖材料，開展植物生物反應器培養體系研究及藏紅花素含量檢測。梔子果實為購買的藥用山梔子果實。本試驗在南京工業大學生物資源工程研究所開展。

1.2 植物生物反應器培養

取30 d固體預培養的愈傷組織15 g，轉接至含有1 000 mL液體培養基的植物生物反應器內，于 24 ℃ 下進行暗培養，間歇浸沒頻率為3 min/4 h。液體培養基配方為MS+2.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L萘乙酸（NAA）+30 g/L蔗糖，pH值為5.8。在培養基中添加CuSO4、 茉莉酸甲酯（MeJA）進行藏紅花素合成誘導試驗，設置2種添加方式：500 μmol/L CuSO4、500 μmol/L CuSO4+100 μmol/L MeJA，處理組和空白對照均重復接種3個植物生物反應器。

1.3 梔子愈傷的細胞結構觀察

將植物生物反應器培養30 d的愈傷組織放入1%的NaCl溶液中，于120 r/min、28 ℃下搖瓶培養2 d。取少量愈傷組織細胞用中性紅染色，放于光學顯微鏡下觀察。

1.4 梔子愈傷增殖系數的測定

梔子愈傷在反應器中培養30 d后，觀察其生長情況并統計分析。用分析天平稱量梔子愈傷的鮮質量。梔子愈傷增殖系數的測定公式：

梔子愈傷增殖系數=培養30 d后梔子愈傷的鮮質量-轉接時梔子愈傷的鮮質量轉接時梔子愈傷的鮮質量。

1.5 藏紅花素的提取

將不同培養處理的梔子愈傷組織以及梔子果實樣品置于60 ℃恒溫烘箱中5～6 h 至恒質量后研磨得粉末。稱取粉末樣品1 g，用50%甲醇稀釋倒入50 mL離心管中，超聲破碎30 min。再放入振蕩培養箱中室溫振蕩提取2 h，3 500 r/min轉速下離心20 min，取上清液。向離心沉淀物中加入10 mL 50%的甲醇，繼續再振蕩提取1 h，離心后再次回收上清液。將2次上清液合并，于50 ℃旋轉蒸發，50%甲醇（色譜級）溶解浸膏，定容至10 mL，保存備用。

1.6 藏紅花素的檢測

液相色譜檢測前，將50%甲醇溶解的樣品通過0.22 μm有機濾膜過濾。

1.6.1 液相色譜條件的選擇

色譜柱選用Innoval AQ C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流速設置為0.7 mL/min;檢測波長為440 nm;柱溫為25 ℃;流動相：甲醇與水體積比為53 ∶47;進樣量為10 μL。

1.6.2 液相色譜標準曲線的建立

用分析天平精密稱取藏紅花素標準品0.005 g，用50%甲醇稀釋配成0.5 mg/mL藏紅花素標準品母液。取藏紅花素標準品母液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL至5 mL容量瓶中，配成濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.50 mg/mL的標準品溶液。檢測時進樣 10 μL，重復3次，測定完后，建立和繪制標準曲線及線性回歸方程（橫縱坐標分別為溶液濃度和出峰面積）。

1.6.3 數據分析

取處理好的梔子愈傷樣品和對照樣品按照“1.6.1”節中設定的液相色譜條件進行檢測，并按照“1.6.2”節中建立的標準曲線，將與標準品同一出峰時間的峰面積換算成甲醇溶解液中的藏紅花素含量，再根據以下公式，計算得到樣品和對照品中的藏紅花素含量。A為根據標準曲線計算到的濃度（mg/mL），粉末質量為1 g梔子愈傷干質量。

樣品中藏紅花素含量（mg/g）=A×10 mL甲醇定容體積1 g梔子愈傷粉末質量。

試驗數據通過SPSS 20.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 梔子愈傷的植物生物反應器培養體系

梔子愈傷組織的質地結構疏松，隨著培養時間的增加，愈傷塊逐步增大，顏色從白色變為淡黃色，與固體組培培養的愈傷狀態一致;梔子愈傷組織團整體呈淡化黃色，表面較為光滑濕潤，見少量絲狀毛刺（圖1-A）。由于細胞重疊不易將其平鋪展開，遂取少量愈傷放于搖瓶培養將細胞分散，加入1%NaCl溶液可以讓愈傷組織失水，以便觀察細胞結構。在光學顯微鏡下，單個愈傷細胞呈長條狀，中間無隔膜，細胞壁較薄（圖1-B）。

從增殖系數來看（表1），不添加CuSO4，當培養時間為40 d時，增殖系數達到1.902。培養20 d時，增殖系數最低，為1.175。由此可知，在40 d的培養時期內，梔子愈傷組織在植物生物反應器中增殖狀態良好，且仍有繼續增殖的趨勢（圖2-A、圖2-B）。

添加CuSO4和MeJA后，在植物生物反應器中培養30 d梔子愈傷細胞團顏色基本呈褐色（圖2-C、圖2-D），愈傷細胞團的數量比對照培養組少，愈傷組織增殖緩慢。添加500 μmol/L CuSO4的梔子愈傷增殖系數為0.487，添加2種誘導劑的梔子愈傷增殖系數為0.348（表1）。由此可知，添加一定濃度的MeJA、CuSO4對梔子愈傷的生長具有抑制作用，不利于愈傷組織的增殖。

2.2 產藏紅花素培養條件的優化

2.2.1 藏紅花素標準曲線的建立

根據不同濃度藏紅花標準品的HPLC檢測峰圖數據，繪制藏紅花素濃度的標準曲線（圖3），并得到計算公式：y=64 584.0x-1 407.9，r2=0.998 1。其中，y為峰面積，mAu·s;x為藏紅花素含量，mg/mL。

2.2.2 不同處理梔子愈傷組織中的藏紅花素含量

試驗中發現，固體培養30 d和反應器培養20 d的樣品峰面積太小，含量達不到檢測下限。除此之外，梔子果實、植物生物反應器中培養30、40 d，以及添加CuSO4和MeJA后培養30 d的梔子愈傷的提取物中均有明顯的藏紅花素檢測峰。本試驗中藏紅花素的出峰時間為（4.4±0.1） min（圖3）。

根據標準曲線計算進樣樣品中藏紅花素含量，并利用“2.2.1”節中的計算公式換算各個樣品中藏紅花素的質量濃度。不同樣品中的藏紅花素含量見表2。

由表2可知，梔子果實中的藏紅花素含量為6.74 mg/g，與相關研究報道的梔子果實中藏紅花素含量[9]基本一致。植物生物反應器中培養30 d的愈傷組織中藏紅花素含量為0.145 4 mg/g，40 d為0.206 5 mg/g，二者間差異顯著（圖4）。添加誘導劑處理后，藏紅花素含量顯著增加，其中添加CuSO4處理后藏紅花素含量為0.350 9 mg/g，2種誘導劑組合處理為0.373 2 mg/g（表2），相較不添加誘導劑的處理中藏紅花素含量差異顯著。由此可得，誘導劑的添加能顯著提高梔子愈傷中藏紅花的含量。

3 討論與結論

本試驗建立了梔子愈傷的植物生物反應器高通量擴繁體系，并分析了不同培養時間（20、30、40 d）和誘導劑處理的梔子愈傷組織中的藏紅花素含量。以固體組培瓶中培養30 d的梔子愈傷為增殖材料，在培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH值為5.8的條件下，植物生物反應器中梔子愈傷的增殖狀態良好，增殖系數高，優于同期的固體培養。同時，培養40 d的單質量梔子愈傷的藏紅花素含量顯著高于培養20、30 d的梔子愈傷組織，表明在一定的培養時期內藏紅花素含量隨愈傷的增殖而積累。誘導劑可促進梔子愈傷組織中藏紅花素合成，添加CuSO4和MeJA 2種誘導劑時，單質量梔子愈傷中的藏紅花素含量顯著增加，達到0.372 3 mg/g。

按照結實情況，梔子分為藥用梔子和賞花梔子。廣泛種植的賞花梔子（如重瓣梔子、大花梔子）只開花不結果;山梔子及其變種水梔子為主要的藥用梔子品種，由于栽培條件、品種資源和生產加工方式的制約，其栽培和利用尚未形成規模，影響了藏紅花素等活性物質的制備和開發應用。植物細胞工程手段為藏紅花素的快速高效生產提供了可行的技術方案。已有相關研究利用選育的藏紅花細胞系和梔子細胞系來制備藏紅花素[12，16]，并有研究利用固液2步法來提高梔子愈傷組織中藏紅花素的產量[17]。本試驗利用植物生物反應器培養梔子愈傷組織，表現了較高的增殖效率，且培養周期短，不受土地、環境、季節的影響，具備生產藏紅花素的潛力。

本試驗結果表明，梔子愈傷中藏紅花素含量明顯低于梔子果實中的含量;添加誘導劑在一定程度上抑制了愈傷組織的增殖，實際每罐植物生物反應器的梔子愈傷產量較低，影響了藏紅花素收率。后續試驗將根據反應器中梔子愈傷的生長狀態和藏紅花素含量積累規律，重點研究植物生物反應器的培養條件優化，如生長激素濃度、誘導劑組合和誘導劑添加時間等，探討梔子愈傷組織在植物生物反應器中的有效培養周期以及藏紅花素的有效積累時間，以期建立持續制備藏紅花素的高產體系。

參考文獻：

[1]任治軍，張立明，何開澤. 梔子主要成分的提取工藝及藥理研究進展[J]. 天然產物研究與開發，2005，17（6）：831-836，803.

[2]潘 媛，李隆云，王 鈺，等. 我國主要梔子栽培資源分布與綜合利用調查[J]. 天然產物研究與開發，2019，31（10）：1823-1830.

[3]袁麗紅，陸玉婷，黃 晶. 藏紅花愈傷組織誘導和褐化抑制[J]. 南京工業大學學報（自然科學版），2009，31（6）：21-26.

[4]楊 艷，湯玉喜，唐 潔，等. 藥食兩用黃梔子果實有效成分及其與農藝性狀的相關性[J]. 中南林業科技大學學報，2019，39（1）：15-19.

[5]Chen Q C，Zhang W Y，Youn U，et al. Iridoid glycosides from gardeniae fructus for treatment of ankle sprain[J]. Phytochemistry，2009，70（6）：779-784.

[6]段 啟，陳華師. HPLC法測定不同產地梔子中藏紅花素的含量[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2010，21（3）：299-301.

[7]吳 敏，谷令彪，劉華敏，等. 梔子果油及藏紅花素的分步萃取研究[J]. 食品科技，2017，42（1）：231-235.

[8]倪勤學，高前欣，徐志豐，等. 2種梔子果主要經濟性狀及梔子果仁油成分分析[J]. 中國糧油學報，2017，32（10）：78-84.

[9]石鳳鳴，王文君，陳 雛，等. 梔子指紋圖譜及不同生長期西紅花苷和梔子苷含量的研究[J]. 時珍國醫國藥，2011，22（8）：1874-1876.

[10]付小梅，王崢濤. 西紅花苷-1的穩定性研究[J]. 食品科學，2012，33（5）：71-73.

[11]陳 雁，楊中林，張雷紅，等. HPLC法同時測定梔子中藏紅花素和藏紅花酸的含量[J]. 內蒙古中醫藥，2011，30（2）：64-65.

[12]陳書安，王曉東，趙 兵，等. 產藏紅花素梔子愈傷組織的誘導和篩選[J]. 中國生物工程雜志，2006，26（6）：50-54.

[13]陳集雙，張本厚. 高通量植物生物反應器及其在遺傳資源挖掘中的應用[J]. 生物資源，2020，42（1）：117-123.

[14]張保錢，樊小寬，金磊磊，等. 利用植物生物反應器培養白及種苗的動力學模型[J]. 科技通報，2019，35（9）：35-42.

[15]張 杰，張本厚，賈明良，等. 利用間歇浸沒植物生物反應器進行半夏組培快繁的研究[J]. 科技通報，2018，34（1）：95-100.

[16]Chen S，Wang X D，Zhao B，et al. Screening of Crocus sativus L.callus lines for crocin production [J]. Chinese Bulletin of Botany，2004，39（4）：455-460.

[17]郭志剛，鄧 穎，劉瑞芝. 固液兩步法的藏紅花素生物合成[J]. 清華大學學報（自然科學版），2003，43（12）：1609-1612.