柴胡種子質(zhì)量與生理指標的相關(guān)性

袁夢佳 楊太新 劉國庫 馮欣如 楊萌

摘要：測定柴胡不同分枝種子的千粒質(zhì)量、發(fā)芽率及簡化活力指數(shù)等質(zhì)量指標;利用考馬斯亮藍G-250染色法測定種子可溶性蛋白的含量;蒽酮比色法測定種子可溶性糖、淀粉的含量;紫外吸收法測定種子SOD、POD、CAT酶活性;高效液相色譜法測定種子ABA、IAA、GA3、ZR內(nèi)源激素含量。結(jié)果表明，不同分枝種子的千粒質(zhì)量、發(fā)芽勢、發(fā)芽率及簡化活力指數(shù)均差異顯著，千粒質(zhì)量以主莖頂端種子的最高，為1.21 g;發(fā)芽勢、發(fā)芽率及簡化活力指數(shù)均以一級分枝的最高，分別為34.3%、60.5%、2.01。不同分枝種子的可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉含量均差異顯著，種子的可溶性蛋白、可溶性糖含量均以主莖頂端的最高，分別為2.21、2.28 mg/g;一級分枝種子的淀粉含量最高，為0.72%。不同分枝種子的SOD、POD、CAT活性均差異顯著，均以一級分枝的最高，分別為20.45、55.31、100.02 U/g。不同分枝種子的ABA、GA3、IAA、ZR含量均差異顯著，三級分枝種子的ABA含量最高，為192.55 ng/g，一級分枝種子的GA3含量（8.99 ng/g）和ZR含量（6.77 ng/g），均為最高，主莖頂端種子的IAA含量最高，為68.33 ng/g。種子的簡化活力指數(shù)與其可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉含量，SOD、POD、CAT酶活性及ZR含量均呈顯著正相關(guān)，與GA3含量呈極顯著正相關(guān)，與ABA含量呈極顯著負相關(guān)。結(jié)論：植株主莖頂端、一級分枝的種子質(zhì)量較高，適宜繁育留種。

關(guān)鍵詞：柴胡;種子質(zhì)量;貯藏物質(zhì);酶活性;內(nèi)源激素

中圖分類號： S567.7+90.1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0120-04

收稿日期：2021-05-18

基金項目：河北省中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（編號：HBCT2018060202）;太行山農(nóng)業(yè)創(chuàng)新驛站安國藥博園（編號：1717050）。

作者簡介：袁夢佳（1994—），女，河南平頂山人，碩士研究生，研究方向為藥用作物栽培。E-mail：937379022@qq.com。

通信作者：楊太新，博士，教授，研究方向為藥用作物栽培。E-mail：yangtaixin@126.com。

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根，按性狀不同，分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”，其味辛、苦，微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)。柴胡主要功效為疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣，用于感冒發(fā)熱、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛[1]。

近年來，柴胡的市場需求量逐漸增大，人工栽培面積不斷增大，但作為繁殖材料的柴胡種子存在發(fā)芽率低、發(fā)芽周期長等問題，嚴重影響柴胡質(zhì)量的穩(wěn)定。目前有關(guān)柴胡種子的研究主要集中于胚發(fā)育過程[2-4]、休眠特性[5-7]、萌發(fā)特性[8-10]等方面，關(guān)于柴胡不同分枝種子的質(zhì)量與其生理指標的相關(guān)性鮮見報道。本試驗研究了柴胡不同分枝種子的含水率、千粒質(zhì)量、發(fā)芽率、簡化活力指數(shù)等質(zhì)量指標，測定其可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、玉米素核苷（ZR）含量等生理指標，分析種子質(zhì)量與生理指標的相關(guān)性，旨在為進一步提高柴胡種子質(zhì)量和良種繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為河北省邯鄲市涉縣柴胡種植基地的冀柴1號柴胡種子，室內(nèi)試驗于2020年11月10日至12月31日在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材栽培實驗室A2417進行。

試驗設(shè)備：BIC-250型智能光照培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司）;超低溫冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）;UH5300型紫外分光光度計[天美（中國）科學(xué)儀器有限公司];NAI-DCY-24F型氮吹儀（上海那艾精密儀器有限公司）;Agilent1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）等。

試劑：GA3、IAA、ZR、ABA標準品均購自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑還有濃硫酸、分析蔗糖、牛血清蛋白、分析葡萄糖、考馬斯亮藍-G250溶液、蒽酮等。

1.2 試驗方法

選擇生長良好、整齊一致的冀柴1號植株200株，分別采取植株主莖頂端、一級分枝、二級分枝、三級分枝的成熟種子[11-12]。分別測定不同分枝種子的含水率、發(fā)芽率、千粒質(zhì)量，分析種子的可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉含量，SOD、POD、CAT活性及ABA、GA3、IAA、ZR含量。指標測定均重復(fù)3次，進行種子簡化活力指數(shù)和貯藏物質(zhì)、酶活性、內(nèi)源激素含量的相關(guān)性分析。

1.2.1 含水率測定

種子含水率=（m3-m2）/（m3-m1）×100%。式中：m1為干燥樣品盒質(zhì)量（g）;m2為干燥樣品盒和烘后樣品總質(zhì)量（g）;m3為干燥樣品盒和烘前樣品總質(zhì)量（g）。

1.2.2 千粒質(zhì)量測定

采用常規(guī)稱質(zhì)量法，隨機選擇1 000粒種子，進行稱質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 發(fā)芽率測定

發(fā)芽勢=規(guī)定時間內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

簡化活力指數(shù)=∑Gt/t×m;式中：Gt為單位時間（d）內(nèi)發(fā)芽數(shù);t為相應(yīng)發(fā)芽時間（d）;m為平均苗鮮質(zhì)量（g）。

1.2.4 貯藏物質(zhì)含量測定

稱取0.500 g種子，用研缽研磨后待測，考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量[13];蒽酮比色法測定可溶性糖、淀粉含量[14]。

1.2.5 酶活性測定

稱量0.100 g種子，加入1 mL的提取液冰浴研磨勻漿后待測。紫外吸收法測定柴胡不同分枝種子的SOD、POD、CAT活性[15]。

1.2.6 內(nèi)源激素含量測定

1.2.6.1 色譜條件

色譜柱AgilentTC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;甲醇作為流動相A，pH值=3的冰乙酸作為流動相B，按照表1進行梯度洗脫;柱溫：30 ℃;流速：1.0 mL/min;進樣量：10 μL/次;檢測波長：254 nm。

1.2.6.2 樣品的制備

稱取約1.000 g種子至預(yù)冷研缽中，加入預(yù)冷的80%甲醇溶液8 mL，用液氮研磨勻漿，4 ℃避光浸提16 h。浸提液4 ℃ 16 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至10 mL離心管中， 加入0.1 g/g的PVPP去除酚類等雜質(zhì)，超聲振蕩40 min過濾，濾液過C18固相萃取柱，將流出液氮吹至水相。用1.0 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)pH值=3.0，加入3 mL乙酸乙酯萃取，超聲振蕩40 min，轉(zhuǎn)移上部液體至新的離心管氮吹（吹干乙酸乙酯），加2 mL甲醇復(fù)溶，過0.45 μm有機濾膜即進瓶樣品，樣品備用[16-17]。

1.2.6.3 線性關(guān)系建立

將混合對照品溶液用0.45 μm有機濾膜過濾，分別精確吸取混合對照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進樣。以進樣體積為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算出回歸方程ABA：Y1=4 856.9x+27.1（r2=0.999 4）;GA3：Y2=83.651x+28.883（r2=0.999 0）;IAA：Y3=736.35x+118.7（r2=0.999 1）;ZR：Y4=88.403x+79.086（r2=0.999 1）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分枝種子的質(zhì)量分析

柴胡不同分枝種子的含水率差異不顯著，種子的千粒質(zhì)量、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和簡化活力指數(shù)均差異顯著（表2）。不同分枝種子含水率的變化范圍為6.73%～7.21%;種子千粒質(zhì)量以主莖頂端的最高，為1.21 g，三級分枝的最低，為0.67 g;不同分枝種子的萌發(fā)啟動時間為9～15 d。發(fā)芽高峰時間為 14～19 d;種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、簡化活力指數(shù)均以一級分枝的最高，分別為34.3%、60.5%、2.01;其次是主莖頂端的，分別為29.8%、54.3%、1.92;三級分枝的最低，分別為11.6%、20.1%、1.43。

2.2 不同分枝種子的生理指標分析

2.2.1 不同分枝種子的貯藏物質(zhì)分析

柴胡不同分枝種子的可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉含量均差異顯著（表3）。可溶性蛋白含量以主莖頂端的最高，為2.21 mg/g，其次為一級分枝的1.67 mg/g，二級分枝與三級分枝差異不顯著，分別為1.04、1.06 mg/g。可溶性糖含量以主莖頂端的最高，為 2.28 mg/g，由高到低順序依次為主莖頂端>一級分枝>二級分枝>三級分枝。淀粉含量以一級分枝的最高，為0.72%，其次是主莖頂端的0.64%，三級分枝的最低，僅為0.37%。

2.2.2 不同分枝種子的酶活性分析

由表4可見，柴胡不同分枝種子的SOD、POD、CAT活性均差異顯著。種子的SOD活性以一級分枝的最高，為 20.45 U/g，由高到低順序依次為一級分枝>主莖頂端>二級分枝>三級分枝。一級分枝種子的POD活性最高，為55.31 U/g，主莖頂端的次之，三級分枝的最低，為37.35 U/g。一級分枝種子的CAT活性最高，為100.02 U/g，由高到低順序依次為一級分枝>主莖頂端>二級分枝>三級分枝。

2.2.3 不同分枝種子的內(nèi)源激素含量分析

柴胡不同分枝種子的ABA、GA3、IAA、ZR含量均差異顯著（表5）。種子的ABA含量以三級分枝的最高，為192.55 ng/g，由高到低順序依次為三級分枝>二級分枝>主莖頂端>一級分枝。一級分枝種子的GA3含量最高，為8.99 ng/g，其次為主莖頂端的，三級分枝的最低，為5.66 ng/g。主莖頂端種子的IAA含量最高，為68.33 ng/g，其次為一級分枝的 66.01 ng/g，兩者差異不顯著，但均顯著高于二級分枝和三級分枝。種子的ZR含量以一級分枝的最高，為6.77 ng/g，由高到低順序依次為一級分枝>主莖頂端>二級分枝>三級分枝。

2.3 柴胡種子簡化活力指數(shù)和生理指標的相關(guān)性分析

柴胡種子簡化活力指數(shù)和生理指標的相關(guān)性分析結(jié)果表明：柴胡種子的可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉含量均與種子簡化活力指數(shù)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.672、0.667、0.670。種子的SOD、POD、CAT活性均與種子簡化活力指數(shù)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.676、0.796、0.736。種子ABA含量與種子簡化活力指數(shù)呈極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 -0.953。GA3含量與種子簡化活力指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.801。ZR含量與種子簡化活力指數(shù)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.732。IAA含量與種子簡化活力指數(shù)未達到顯著相關(guān)水平（表6）。

3 討論與結(jié)論

千粒質(zhì)量、發(fā)芽率、簡化活力指數(shù)是檢測種子質(zhì)量的重要指標[18-21]。本試驗結(jié)果顯示：柴胡不同分枝種子的含水率差異不顯著，千粒質(zhì)量、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和簡化活力指數(shù)不同分枝間均顯著差異;種子千粒質(zhì)量以主莖頂端的最高;不同分枝種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、簡化活力指數(shù)呈相同變化趨勢，均以一級分枝的最高，這與李振華等對烤煙不同分枝種子活力的分析[22]及李孟良對油菜不同部位種子千粒質(zhì)量及種子活力的研究結(jié)論[23]基本一致。

蛋白質(zhì)、糖類、淀粉等物質(zhì)為種子發(fā)芽提供氮源、碳源和能量，種子內(nèi)淀粉、可溶性糖含量的變化與種子簡化活力指數(shù)具有顯著相關(guān)關(guān)系[24-26]。本研究結(jié)果表明：柴胡不同分枝種子的可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉含量均差異顯著。可溶性蛋白含量、可溶性糖含量均以主莖頂端的最高，分別為2.21、2.28 mg/g，淀粉含量以一級分枝的最高，為0.72%。柴胡種子簡化活力指數(shù)與種子的可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉含量均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.672、0.667、0.670，該結(jié)果與前人對牛膝[21]、玉米[25]的研究相似。

種子萌發(fā)與其內(nèi)部的SOD、POD、CAT抗氧化酶活性密切相關(guān)[27-28]。本試驗結(jié)果表明：柴胡不同分枝種子的SOD、POD、CAT活性均存在顯著差異，這也與錢可等對小麥不同穗部位種子酶活性比較研究結(jié)論[29]基本一致。另外，柴胡種子簡化活力指數(shù)與其SOD、POD、CAT酶活性均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.676、0.796、0.736，這與張勝珍等對黑柴胡種子的研究結(jié)果[24]是一致的。

內(nèi)源激素具有調(diào)控種子萌發(fā)的作用[30-31]。本研究結(jié)果顯示：柴胡不同分枝種子的ABA、GA3、ZR、IAA含量均差異顯著。種子ABA含量以三級分枝的最高，種子GA3、ZR含量均以一級分枝的最高。另外，種子簡化活力指數(shù)與ABA含量呈極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.953;而與GA3含量呈極顯著正相關(guān)（r=0.801），與ZR含量呈顯著正相關(guān)（r=0.732），與IAA含量呈正相關(guān)，但未達到顯著水平。

從柴胡種子的質(zhì)量指標得出，植株主莖頂端、一級分枝種子的千粒質(zhì)量、發(fā)芽率及簡化活力指數(shù)較高，適宜繁育留種。種子質(zhì)量與GA3、ZR等內(nèi)源激素含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，可通過不同外源生長調(diào)節(jié)劑處理促進種子萌發(fā)，進一步提高柴胡種子發(fā)芽率。關(guān)于柴胡生長調(diào)節(jié)劑種類選擇及處理方法有待進一步探討。

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