荷花花粉活力的檢測(cè)方法比較分析

梁露 孔德政 劉卓星 李瀚純 劉青青 劉鳳欒 張大生 田代科

摘要：為探究快速有效地檢測(cè)荷花花粉活力的方法，選出適用于大部分荷花花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基，篩選花粉活力較高的品種，以11份不同資源荷花的花粉為材料，利用離體培養(yǎng)法、I2-KI染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法對(duì)荷花花粉活力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，I2-KI染色法和TTC染色法檢測(cè)得到的花粉染色率均與離體培養(yǎng)得到的萌發(fā)率結(jié)果不符。易建蓮花粉萌發(fā)率在5-1培養(yǎng)基（10%PEG 4000、0.02%硼酸、0.1%蔗糖）上最高，為9.86%。野生蓮中的泰國(guó)蓮、越南蓮的花粉離體萌發(fā)率分別為16.45%、16.67%，品種荷花中單灑錦的離體萌發(fā)率則高達(dá)18.46%。由研究結(jié)果得出：（1）3種花粉活力測(cè)定方法中，離體培養(yǎng)法適用于檢測(cè)荷花的花粉活力，而I2-KI染色法和TTC染色法并不適合;（2）適合荷花花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基是含10%PEG 4000、0.02%硼酸、0.1%蔗糖的液體培養(yǎng)基;（3）野生蓮中，泰國(guó)蓮、越南蓮的花粉活力較高，而在品種荷花中，單灑錦的花粉活力最高。

關(guān)鍵詞：荷花;花粉活力;染色;培養(yǎng)基;I2-KI染色法;TTC染色法

中圖分類號(hào)：S682.320.1 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）02-0131-06

收稿日期：2021-05-11

基金項(xiàng)目：上海市綠化和市容管理局科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：G162402、G182412）。

作者簡(jiǎn)介：梁 露（1996—），女，河南信陽人，碩士研究生，主要從事園林植物育種研究。E-mail：1165134110@qq.com。

通信作者：田代科，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事觀賞植物資源分類評(píng)價(jià)、種質(zhì)創(chuàng)新及重要性狀遺傳機(jī)制研究。E-mail：dktian@cemps.ac.cn。

蓮別稱荷花，是蓮科（Nelumbonaceae）蓮屬（Nelumbo）的多年生挺水植物，是最古老的雙子葉植物之一，目前僅存有美洲蓮（Nelumbo lutea）和亞洲蓮（N. nucifera）2個(gè)種。荷花集觀賞、食用、藥用等功能于一體，具有重要的文化價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值、生態(tài)價(jià)值[1-2]。

花粉是植物體上起生殖作用的雄配子體[3]，其活力直接影響到植物受精和結(jié)實(shí)過程，較高的花粉活力可以提高植物的結(jié)實(shí)率和育種成效。荷花花粉含有豐富的類黃酮，目前針對(duì)荷花藥用價(jià)值的研究較多[4-5]，而對(duì)其活力的研究較少[6]。全世界目前已有的2 000多個(gè)荷花品種主要由中國(guó)和日本培育而成[7]，育種方法主要是自然雜交和人工雜交，少部分采用物理或化學(xué)誘變方法[8-10]，然而在荷花雜交過程中常出現(xiàn)不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率低的問題。因此，了解花粉活力情況對(duì)于荷花雜交育種過程至關(guān)重要，如不同種類的荷花花粉活力是否存在差異及差異多大，如何更有效地檢測(cè)荷花的花粉活力，如何更有效地儲(chǔ)藏花粉使其活力保存較長(zhǎng)時(shí)間等問題目前尚不清楚。

離體培養(yǎng)法和染色法是測(cè)定植物花粉活力的常用方法，已經(jīng)在百合[11]、牡丹[12]、巴旦木[13]、菊花[14]、君子蘭[15]等植物中得到了廣泛應(yīng)用。本研究以不同資源荷花的花粉為試驗(yàn)材料，分別采用離體培養(yǎng)法、碘-碘化鉀（I2-KI）染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法進(jìn)行活力檢測(cè)，以離體培養(yǎng)法作為參照，比較2種染色方法的測(cè)定結(jié)果，從而對(duì)不同資源荷花的花粉活力進(jìn)行比較分析。

在對(duì)荷花進(jìn)行人工雜交前，先對(duì)花粉活力進(jìn)行準(zhǔn)確有效的檢測(cè)，選出花粉活力強(qiáng)的品種作為父本，進(jìn)而選擇合適的雜交母本，是保證雜交育種工作順利開展和提高效率的重要條件。本研究期望得出有效、快速地檢測(cè)荷花花粉活力的方法，從而篩選出花粉活力較高的荷花品種，為荷花新品種的高效培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

表1中的試驗(yàn)材料為取自上海辰山植物園國(guó)家荷花資源圃的11份不同資源的荷花，包括美洲蓮、亞洲蓮及亞美雜交蓮，均為單瓣型（圖1），因考慮到單瓣型荷花雄蕊發(fā)育正常，花粉活力通常更高。試驗(yàn)材料采集時(shí)選擇天氣晴朗的08：00左右，選取開花第2天的荷花，荷花花蕾在開花前用種子袋套上，避免因蜜蜂采蜜導(dǎo)致授粉雜交。試驗(yàn)于2020年7—9月在上海辰山植物園中國(guó)科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心的觀賞植物資源及創(chuàng)新利用研究組247實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉的收集 用一次性唇刷將花粉從花藥上輕刷下來，放在培養(yǎng)皿中的硫酸紙上，蓋上培養(yǎng)皿備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的選擇 影響花粉萌發(fā)的主要因素有蔗糖、硼酸等[16]。聚乙二醇（PEG）可以促進(jìn)種子萌發(fā)[17]，也可以使花粉緩慢水合，從而較長(zhǎng)時(shí)間地維持花粉膨壓，對(duì)花粉萌發(fā)也有一定的促進(jìn)作用[18-20]。由前期的試驗(yàn)結(jié)果可知，荷花在固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)率較低，結(jié)合孫春青等的方法[21]，最終選用液體培養(yǎng)基。

為了得到適用于大多數(shù)荷花花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基，設(shè)置PEG-4000（含量分別為0、10%、15%）、蔗糖（含量分別為0、5%、10%）、硼酸（含量分別為0、0.01%、0.02%）3個(gè)因素的3個(gè)水平，共設(shè)計(jì)15種組成不一的培養(yǎng)基（表2），并選擇3個(gè)荷花品種的花粉做培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)，分別為粉霸王、易建蓮、巨姚。分別將3個(gè)荷花品種的花粉撒于15種培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中于30? ℃培養(yǎng)4 h后，使用奧林巴斯BX43正置顯微鏡，在放大10倍的條件下觀察花粉的萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。在離體培養(yǎng)法中，當(dāng)花粉管的長(zhǎng)度大于花粉粒的直徑時(shí)視為萌發(fā)[22]。上述每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察3個(gè)視野。

1.2.3 離體培養(yǎng)法 配制培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于干凈的凹面載玻片上，取花粉均勻撒在培養(yǎng)基上，然后將其放入內(nèi)置濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中于30 ?℃培養(yǎng)4 h后，鏡檢觀察花粉的萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察3個(gè)視野。

1.2.4 I2-KI染色法 配制I2-KI溶液（稱量 0.2 g KI溶于8 mL蒸餾水中，充分溶解后，加入 0.1 g I2定容至30 mL，振蕩使其充分溶解）于棕色滴瓶中，避光備用。取適量花粉于PCR管中，將PCR管用錫箔紙包裹避光，再向管中加入200 μL I2-KI 溶液，輕輕振蕩混勻，然后在黑暗條件下染色5 min。滴2～3滴染色液于載玻片上，鏡檢觀察，被染成藍(lán)色的花粉視為有活力，未被染色的花粉則視為無活力。上述每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察3個(gè)視野。

1.2.5 TTC染色法 配制0.5%TTC溶液（稱量0.05 g TTC溶于10 mL磷酸緩沖液中）于棕色滴瓶中，避光備用，溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。取適量花粉于PCR管中，將PCR管用錫箔紙包裹避光，再向管中加入200 μL TTC溶液，輕輕振蕩混勻，然后放入 37? ℃ 培養(yǎng)箱中黑暗染色15 min。滴2～3滴染色液于載玻片上，鏡檢觀察，被染成紅色的花粉是有活力的，未被染色的花粉是無活力的。上述每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察3個(gè)視野。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。離體培養(yǎng)法的花粉活力計(jì)算公式：花粉萌發(fā)率=已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù)×100%;染色法的花粉活力計(jì)算公式：花粉染色率=已染色的花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的篩選

如圖2所示，在PEG-4000濃度為0的培養(yǎng)基上，1-1、1-2、1-3、1-4、1-5培養(yǎng)基中的花粉未萌發(fā);在PEG-4000含量為15%的培養(yǎng)基上，3-2、3-3、3-4、3-5培養(yǎng)基中的花粉幾乎未萌發(fā)（萌發(fā)率<1%）;在 PEG-4000含量為10%的培養(yǎng)基上，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5培養(yǎng)基中的花粉萌發(fā)情況較好。由此看出，適宜含量的PEG-4000確實(shí)可以提高荷花花粉的萌發(fā)率，但當(dāng)含量過高時(shí)，反而會(huì)抑制其萌發(fā)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蔗糖含量為0時(shí)，花粉的萌發(fā)率較高，蔗糖含量為5%、10%時(shí)，花粉的萌發(fā)率偏低，表明萌發(fā)率隨著蔗糖含量升高而降低。而花粉萌發(fā)率在硼酸含量為0.02%的培養(yǎng)基上較高，在硼酸含量為0.01%的培養(yǎng)基上較低。在2-5培養(yǎng)基上，易建蓮荷花品種的平均花粉萌發(fā)率最高。綜合考慮，為了滿足大多數(shù)荷花的花粉都能良好萌發(fā)且萌發(fā)條件一致，選擇2-5培養(yǎng)基用于花粉萌發(fā)。

選擇易建蓮進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，然而由于2-5培養(yǎng)基的蔗糖含量為0，因此設(shè)定PEG-4000含量為10%、硼酸含量為0.02%，添加不同含量的蔗糖再次進(jìn)行培養(yǎng)基試驗(yàn)。由表3可以看出，易建蓮花粉在5種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率隨著蔗糖含量的升高而先升高后降低，在5-1培養(yǎng)基上達(dá)到最高值，為9.86%，說明一定濃度的蔗糖可以促進(jìn)花粉萌發(fā)，但當(dāng)蔗糖含量過高時(shí)，花粉萌發(fā)反而被抑制。最終選擇5-1培養(yǎng)基作為測(cè)定荷花花粉活力的液體培養(yǎng)基，其配方：10%PEG-4000+0.02%硼酸+0.1%蔗糖。

2.2 2種染色法的觀測(cè)效果

在本試驗(yàn)中，I2-KI染色法、TTC染色法均能對(duì)荷花的花粉進(jìn)行有效染色（圖3-B、圖3-C）。在顯微鏡下，花粉形態(tài)清晰，但2種染色方法的著色區(qū)分度有較大差異。經(jīng)I2-KI染色后，大多數(shù)荷花花粉均呈褐黑色或黃褐色，極少數(shù)有未著色的花粉粒。經(jīng)TTC染色后，荷花花粉呈紅色或淡紅色，部分花粉粒未著色，易區(qū)分。

2.3 3種花粉活力檢測(cè)方法的比較

用3種方法檢測(cè)荷花花粉活力發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)法和TTC染色法檢測(cè)得到的所有荷花花粉的活力均低于45%，而I2-KI染色法檢測(cè)得到的荷花花粉活力均高于70%（表4、圖3）。

離體培養(yǎng)法使用前期試驗(yàn)得到的最適培養(yǎng)基來檢測(cè)不同荷花的花粉活力。由圖4可以看出，用離體培養(yǎng)法檢測(cè)得到11種不同資源的荷花花粉萌發(fā)率均低于20.00%，其中單灑錦的花粉活力最高，為18.46%，黑龍江野生蓮的花粉活力最低，為6.70%。

使用I2-KI染色法測(cè)定荷花花粉活力時(shí)，染色后的花粉呈褐黑色或黃褐色，在顯微鏡觀察下發(fā)現(xiàn)其色差不明顯，同時(shí)花粉著色率極高，僅有少數(shù)花粉未著色。因此，如果僅以著色率來表示花粉的活力，那么I2-KI染色法檢測(cè)得到的不同荷花花粉的活力均超過70%（圖5），這與離體培養(yǎng)得到的結(jié)果嚴(yán)重不符，因此認(rèn)為這種染色法不適合用于檢測(cè)荷花花粉的活力。

使用TTC染色法測(cè)定荷花花粉活力時(shí)，不同荷花檢測(cè)得到的花粉活力差別較大。由圖6可以看出，越南蓮的花粉活力最高，達(dá)到了43.39%，江溪紅蓮的花粉活力最低，為11.24%。與離體培養(yǎng)結(jié)果比較可知，TTC染色法測(cè)得的花粉活力明顯偏高，此方法雖然容易操作，染色后花粉的著色情況容易區(qū)分，但是得到的結(jié)果普遍高于離體培養(yǎng)法，且與離體培養(yǎng)中得到的染色率比例不一致，不能準(zhǔn)確反映花粉活力，因此該方法也不適用于荷花花粉活力的檢測(cè)。

3 討論與結(jié)論

花粉活力直接影響雜交授粉后卵子受精和結(jié)實(shí)率的結(jié)果，因此，雜交育種試驗(yàn)之前需要了解荷花花粉的活力，優(yōu)先選擇花粉活力高的品種作為父本，更利于新品種的成功培育[23-25]。測(cè)定花粉活力的方法較多，不同植物適用的檢測(cè)方法不同。花粉活力檢測(cè)多采用染色法，因其操作過程簡(jiǎn)易、試驗(yàn)耗時(shí)少、能在較短時(shí)間內(nèi)測(cè)定花粉活力等優(yōu)點(diǎn)而被應(yīng)用于各種植物中。研究發(fā)現(xiàn)，大部分檢測(cè)方法得到的花粉活力高于實(shí)際活力[3]。孫光玲等研究發(fā)現(xiàn)，花粉活力的測(cè)定以離體培養(yǎng)法更可靠[26]。于璐通過對(duì)不同番茄品種花粉活力的測(cè)定得出，TTC染色法比I2-KI染色法更適用[27]。王士泉對(duì)于四川牡丹同時(shí)使用亞歷山大染色法、TTC染色法和I2-KI染色法進(jìn)行花粉活力的測(cè)定，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較，認(rèn)為四川牡丹更適用I2-KI染色法[28]。詹妮等發(fā)現(xiàn)，用離體培養(yǎng)法、過氧化物酶法和I2-KI染色法檢測(cè)的大葉相思的花粉活力無顯著差異[29]。

本試驗(yàn)選用離體培養(yǎng)法、I2-KI染色法和TTC染色法來檢測(cè)荷花的花粉活力。試驗(yàn)得到適合所取試驗(yàn)材料萌發(fā)的培養(yǎng)基是含10%PEG 4000、0.02%硼酸、0.1%蔗糖的液體培養(yǎng)基。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同種類荷花花粉活力有一定差異，甚至有的花粉活力差異十分顯著。在野生蓮中，泰國(guó)蓮、越南蓮的花粉活力最高，而黑龍江野生蓮的花粉活力最低，可能因?yàn)樘﹪?guó)蓮和越南蓮是熱帶蓮，與北方資源相比更適應(yīng)上海夏季的高溫，而我國(guó)北方的黑龍江野生蓮屬于從北向南的引種，表現(xiàn)出長(zhǎng)勢(shì)較弱和開花較少的特點(diǎn)，有些北方資源南移到上海后甚至不長(zhǎng)立葉，因此適應(yīng)能力較弱。在品種荷花中，單灑錦的花粉活力最高，推測(cè)可能與該品種適應(yīng)性強(qiáng)、能夠從古流傳至今有一定關(guān)系。

比較3種花粉活力的測(cè)定方法可知，I2-KI染色法、TTC染色法均不適合用于荷花花粉活力的檢測(cè)。離體培養(yǎng)法利用培養(yǎng)基對(duì)荷花花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)，雖然可以進(jìn)行大量樣本測(cè)定，但培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，不適合用于花粉活力的快速測(cè)定。在本研究中，離體培養(yǎng)法得到的荷花花粉萌發(fā)率均較低，分析其原因可能有以下幾點(diǎn)：（1）荷花的花粉活力本身就低;（2）本試驗(yàn)的培養(yǎng)基未使荷花花粉達(dá)到最大萌發(fā)率，有的花粉粒出現(xiàn)破裂的情況，培養(yǎng)基組分還需要進(jìn)一步探索優(yōu)化;（3）培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，花粉活力與實(shí)際值相比可能偏低。I2-KI染色法操作簡(jiǎn)便快速，只需將花粉與染色液混合，并在室溫下避光放置一段時(shí)間即可檢測(cè)花粉活力。此方法是根據(jù)淀粉遇碘變色的原理，變色情況受淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉比例的影響，直鏈淀粉遇碘變藍(lán)色，支鏈淀粉遇碘變紫紅色[30]。而在本試驗(yàn)中，染色后觀察到花粉呈褐黑色、黃褐色，分析認(rèn)為可能是染液的顏色加上直鏈淀粉變藍(lán)及支鏈淀粉變紫紅色疊加呈現(xiàn)的顏色。依據(jù)花粉內(nèi)淀粉的染色情況來判斷花粉活力可知，很可能出現(xiàn)已失活花粉內(nèi)有淀粉尚未水解的情況，此時(shí)花粉仍然會(huì)被染色，就可能導(dǎo)致染色率遠(yuǎn)高于離體培養(yǎng)中觀察到的結(jié)果。在實(shí)際操作過程中，TTC染色法染色液需要現(xiàn)配現(xiàn)用并避光放置，將花粉與染色液混合，并在37? ℃恒溫避光放置一段時(shí)間才可檢測(cè)花粉活力，對(duì)試驗(yàn)操作技術(shù)的要求較高，很容易出現(xiàn)染色失敗、花粉均無法著色的情況，而且其染色結(jié)果與離體培養(yǎng)的結(jié)果不一致，染色率高于離體萌發(fā)率，與郭蓓等的研究結(jié)果[31]一致，此方法原理是無色的TTC與正常活細(xì)胞中的脫氫酶反應(yīng)變成紅色。而部分活力弱的花粉也會(huì)產(chǎn)生脫氫酶，雖然含量低，但也會(huì)被染成淡紅色。經(jīng)分析認(rèn)為，可能是本試驗(yàn)中的荷花花粉中部分活力弱的也著色了，淡紅色與紅色混合在一起，無法完全準(zhǔn)確判定其真實(shí)顏色，導(dǎo)致在判斷過程中受到主觀影響，結(jié)果比實(shí)際萌發(fā)率偏高。在這種情況下，TTC染色法得到的荷花花粉著色率仍然較低，說明荷花花粉活力確實(shí)偏低。

由此可見，不同種類的植物適用的花粉活力檢測(cè)方法各不相同，因此需要通過試驗(yàn)來進(jìn)行比較分析，選擇出最適合研究對(duì)象的測(cè)定方法。本試驗(yàn)采用的離體培養(yǎng)法適合荷花花粉活力檢測(cè)，但效率不高。I2-KI染色法和TTC染色法雖然快速簡(jiǎn)便，但結(jié)果并不準(zhǔn)確，不適合荷花花粉活力的快速檢測(cè)。因此，后續(xù)仍然需要繼續(xù)試驗(yàn)，找到更好的快速準(zhǔn)確的荷花花粉活力檢測(cè)方法。

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