基于尿液代謝組學研究青蒿琥酯對慶大霉素誘導犬急性腎功能衰竭的保護機制

朱道仙 陸江 郝福星 吳植

摘要：為觀察青蒿琥酯對慶大霉素誘導犬急性腎功能衰竭尿液代謝物的調節作用及其機制。將24只泰迪型貴賓犬，隨機等分為3組：對照組（control組）、腎衰組（CRF組）和青蒿琥酯組（ART組）。除對照組，其他組犬采用注射慶大霉素建立急性腎功能衰竭模型。然后，ART組給予青蒿琥酯，對照組和CRF組給予相同體積生理鹽水。用生化分析儀測定肌酐（Cr）和尿素氮含量，用氣相色譜-質譜法（GC-MS）測定尿液中的代謝物水平。結果顯示，與CRF組比較，ART組血清Cr和尿素氮含量極顯著降低（P<0.01）;共有14種代謝物水平發生改變，其中，α-酮戊二酸、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、花生四烯酸、蘋果酸、檸檬酸及棕櫚酸等含量降低;葡萄糖酸、牛磺酸、甘氨酸、肌酐、絲氨酸及甘油等含量升高。代謝通路分析發現共涉及三羧酸循環、甘氨酸代謝、酪氨酸代謝、色氨酸生物合成、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝及不飽和脂肪酸生物合成等7條代謝途徑。以上結果表明，青蒿琥酯可有效改善慶大霉素誘導犬急性腎功能衰竭，可能與調節脂代謝、氨基酸代謝和能量代謝等通路有關。

關鍵詞：青蒿琥酯;慶大霉素;犬;急性腎功能衰竭;尿液代謝組學;代謝通路

中圖分類號：S858.292 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0137-05

收稿日期：2021-05-07

基金項目：江蘇現代農業產業技術體系建設項目（編號：JATS[2018]238）;江蘇農牧科技職業學院校級課題（編號：NSF201706）。

作者簡介：朱道仙（1978—），女，安徽壽縣人，碩士，講師，主要從事動物臨床營養及代謝病研究。E-mail：331802901@qq.com。

通信作者：陸 江，碩士，副教授，主要從事動物臨床營養及代謝病研究。E-mail：vetlj@163.com。

犬的急性腎功能衰竭是由多種病因引起的腎功能快速下降而出現的以氮質血癥為特征的一種臨床綜合征，近年發病率逐漸升高。目前，常采取對癥治療、糾正酸堿平衡紊亂、維持殘腎功能等方法進行治療，效果不一，部分動物病情惡化甚至死亡，尚無有效的治療方法。研究報道，對急性腎功能衰竭進行早期干預可降低腎功能進一步惡化的風險[1-2]。青蒿琥酯（artesunate，ART）具有抗氧化應激、抗炎、抗腫瘤及免疫調節等作用[3]。大量研究表明，ART對多種原因引起的腎損傷具有保護作用[4-5]，然而其作用機制尚不明確。代謝組學是研究細胞、組織、器官或整個生命有機體代謝物（相對分子質量在1 000以下）的組成及這些代謝產物在內外因素刺激下動態變化的一門科學[6]。由于代謝組學側重于反映生物體內真實的病理生理變化狀態，對藥物干預后的作用趨勢具有指導意義，目前代謝組學技術已在各系統疾病的研究中廣泛應用[7]。因此，本研究擬采用氣相色譜-質譜法（GC-MS）的尿液代謝組學檢測方法，探討青蒿琥酯對慶大霉素誘導急性腎功能衰竭模型犬的干預作用，以期闡明青蒿琥酯防治犬急性腎衰竭的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

泰迪型貴賓犬，約4歲，體質量（7±1） kg，雄性，江蘇農牧科技職業學院寵物美容犬房提供。

1.2 試驗設計

于2020年5月，選取24只泰迪型貴賓犬飼養于江蘇農牧科技職業學院實驗動物房，隨機等分為3組：對照組（control組）、腎衰組（CRF組）和青蒿琥酯組（ART組）。所有犬均以商品化成年犬糧（冠能成年犬犬糧，規格12 kg/袋，雀巢普瑞納寵物食品有限公司）進行7 d適應性飼喂后，除對照組，其他各組犬參考張萍等的方法[8]，每天09：00按照 40 mg/kg 體質量肌肉注射硫酸慶大霉素注射液（購于天津藥業焦作有限公司），連續注射5 d，若血清肌酐（Cr）含量及臨床癥狀無明顯變化，則按 40 mg/kg 體質量間隔12 h重復給藥，直至Cr含量>270 μmol/L，尿素氮含量升高，停止用藥，犬急性腎衰模型建立成功。對照組給予等量生理鹽水作為對照。然后，ART組犬按1 mg/kg體質量肌肉注射青蒿琥酯注射液（購于哈爾濱市宏達動物藥品廠），CRF組和Control組給予等量生理鹽水，1次/d，連續5 d。

1.3 血液腎功能指標測定

分別于慢性腎衰造模前（0 d）、造模后（7 d）和試驗結束（12 d）時的08：00，空腹經頭靜脈采集各組試驗犬的血液并制備血清，用M149928-全自動干式生化分析儀測定血清肌酐和尿素氮含量。

1.4 GC-MS法檢測尿液代謝物

1.4.1 尿液采集 試驗結束時，經膀胱穿刺收集新鮮尿液后迅速置于-80? ℃保存，待測。

1.4.2 尿樣處理 參考孟欣等的方法[9]，將“1.4.1”節保存的尿液室溫下融化后，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min后取上清液。取上清液200 μL，加入20 μL脲酶，混合均勻于37 ℃培養箱中孵化反應 20 min，加入 800 μL 冰冷色譜級乙醇，4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min，吸取200 μL上清液轉入高回收率玻璃衍生小瓶中，采用溫和氮氣吹干提取液。向干燥物中加入30 μL 20 mg/mL鹽酸甲氧胺吡啶溶液，37 ℃肟化反應90 min。取出后繼續加入30 μL N，O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（含1%三甲基一氯硅烷）的衍生試劑，密閉并于 70 ℃ 反應60 min。取出樣本，室溫放置30 min，進行GC-MS代謝組學分析。

1.4.3 GC-MS反應條件 GC-MS試驗的儀器分析平臺為安捷倫7890A/5975C GC-MS系統，毛細管色譜柱為Agilent J&W Scientific公司的 HP-5 ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫條件：初始柱溫60 ℃，保留1 min，以20 ℃/min升溫至320 ℃，保留4 min。進樣口溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣作為載氣，不分流進樣，進樣量1.0 μL。質譜條件：電離方式EI，碰撞能量為70 eV，離子源溫度280 ℃，離子傳輸線溫度250 ℃，溶劑延遲時間為4 min，掃描方式為全掃描，質譜檢測范圍為50～600質荷比（m/z）。

1.5 數據處理

計量資料采用“平均值±標準差”表示，采用SPSS 22.0統計軟件ANOVA程序單因素方差分析（one-way ANOVA），并進行多重比較（LSD）組間兩兩比較，同組不同時間點數據用重復測量數據資料方差分析比較。GC-MS所得的樣品數據通過m/z識別、匹配和歸一化等計算過程，得到矩陣，將其導入SIMCA-P 12.0軟件中進行主成分分析（PCA），及偏最小二乘判別分析（PLS-DA），采用MetaboAnalyst網站（http：//www.metaboanalyst.ca/）進行代謝物的代謝通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 腎功能指標的變化

由圖1-a可知，7 d，CRF組和ART血中Cr濃度升高，超出生理閾值（紅色虛線），約為對照組的2.5倍;12 d，與CRF組比較，ART組Cr含量極顯著降低（P<0.01），與對照組比較，CRF組Cr含量極顯著升高（P<0.01）。由圖1-b可知，7 d，CRF組和ART血中尿素氮濃度升高，約為對照組的4倍;12 d，與CRF組比較，ART組尿素氮濃度極顯著降低（P<0.01）;與對照組比較，CRF組尿素氮濃度極顯著升高（P<0.01）。提示ART處理可以改善CRF模型犬的腎功能。

2.2 尿液代謝物的GC-MS總離子流圖的變化

對所有樣本的總離子流色譜圖進行可視化檢查，顯示所有樣本的儀器分析具有信號強、峰容量大且保留時間重現性好等特點。各組以其中1個樣本的總離子流色譜圖為代表，由圖2可知，不同組間的總離子流色譜圖有較大差異。

2.3 多元分析組間差異

在Simca-P 11.0軟件中，采用默認的UV格式化（unit variance scaling）和平均中心（mean-centered）處理，對各組代謝物進行主成分分析（PCA），PCA得分圖（scores plot）見圖3-a，橫坐標為第1主成分得分，用t[1]表示;縱坐標為第2主成分得分，用t[2]表示，所有樣本處于95%置信區間（hotelling T2 ellipse）外，無異常樣本，PCA第1主成分（R2X1）與第2主成分（R2X2）總累積解釋率47.04%，為各組間的樣本點完全分離，各組內樣本點聚集較好。與CRF組比較，ART有向對照組回調趨勢。采用PLS-DA的多維統計分析方法分別對3組樣本進行模型分析，由圖3-b可知，累積解釋率為75.53%，說明3組樣本間具有顯著代謝差異。對PLS-DA分析模式隨機置換200次，進行置換檢測， R2=0.512， Q2=-0.056 8，提示本模型均有較好的穩定性及可預測性且不存在過擬合現象，模型建立成功，見圖3-c。

2.4 差異代謝物篩選

由圖4-a可知，采用PLS-DA模型第1主成分得到VIP（variable importance in the projection）值（VIP>1）、t檢驗P值（P<0.05），并結合變化倍數log2（差異倍數）>4來尋找差異性代謝物。將潛在差異代謝物的二級譜圖與Metlin、HMDB及KEGG等數據庫進行比對。與對照組比較，CRF組有16種差異代謝物，其中甘油、甘氨酸、肌酐、絲氨酸、3-吲哚硫酸及牛磺酸等含量下降;α-酮戊二酸、肌醇、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、蘋果酸、花生四烯酸、蘋果酸、檸檬酸及棕櫚酸等含量升高。由圖4-b可知，與CRF組比較，ART組有14種差異代謝物，其中，α-酮戊二酸、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、花生四烯酸、蘋果酸、檸檬酸及棕櫚酸等含量降低;葡萄糖酸、牛磺酸、甘氨酸、肌酐、絲氨酸及甘油等含量升高。

2.5 差異代謝物代謝途徑富集分析

由圖5可知，共有7條潛在代謝靶標途徑可能參與CRF發生和ART干預，分別為三羧酸循環、甘氨酸代謝、酪氨酸代謝、色氨酸生物合成、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝及不飽和脂肪酸生物合成。說明CRF組犬體內代謝紊亂主要與脂代謝、氨基酸代謝和能量代謝等通路有關，經ART干預后部分代謝物出現回調趨勢，提示代謝通路的紊亂得到相應調節。

3 討論與結論

本試驗使用硫酸慶大霉素誘導犬急性腎衰竭模型，以血液Cr濃度增加至參考值上限的50%為犬急性腎功能衰竭模型建造成功的標準[8]，成功誘導犬急性腎衰竭模型，試驗犬無死亡且易于觀察。造模7 d，血清Cr濃度約為對照組2.5倍，尿素氮濃度約為對照組4倍，證明了犬急性腎衰竭模型復制成功。給予ART治療后，血清Cr和尿素氮濃度等指標均有所改善，說明ART對犬急性腎衰竭具有良好的治療作用。

代謝組學技術是用于考察生物體受到刺激（藥物或環境等）后，其代謝產物發生的動態變化，從而分析生物體生理病理狀態，從整體上反映生物體的變化狀態，避免了以往單一或少數指標研究病理生理變化[10]。GC-MS技術具有分離效果好、分辨度和檢測靈敏度較高，有參考比較的標準圖譜等優點，且尿液樣本容易采集，對動物無損傷[11-13]。因此，本研究采用尿液進行GC-MS分析。

對尿液中代謝物進行差異分析發現，CRF組甘氨酸、肌酐及牛磺酸等含量低于對照組。徐婷婷等[14]在商陸致大鼠腎損傷的代謝組學研究中，發現尿液肌酐含量降低，與本結果研究一致。尿中肌酐含量降低，結合血清肌酐含量及尿素氮含量升高，進一步提示CRF的發生。在線粒體中進行的三羧酸循環是機體提供能量的主要方式，α-酮戊二酸、琥珀酸、蘋果酸及檸檬酸等物質是其重要的中間產物。本研究結果顯示，CRF組尿中這些物質含量高于對照組，提示急性腎衰竭時三羧酸循環發生異常，也間接反映線粒體功能的失調，而線粒體損傷是導致氧化應激的重要因素。給予青蒿琥酯（ART組）后可使α-酮戊二酸、琥珀酸、蘋果酸及檸檬酸等含量回調，說明ART組改善了CRF組患犬三羧酸循環的狀態。甘氨酸作為一種抗氧化劑，可調控脂質過氧化產物丙二醛（MDA）和氧化亞氮水平[15]。牛磺酸具有抗氧化、抗細胞凋亡、調節內質網應激反應、促線粒體蛋白質合成、維持滲透平衡等功能從而達到保護細胞膜的目的[16-17]。CRF組甘氨酸和牛磺酸含量降低，說明機體抗氧化能力減弱，發生氧化應激反應。連續給予青蒿琥酯后甘氨酸、牛磺酸及肌酐含量均顯著回調，而且谷胱甘肽代謝通路改善顯著，表明青蒿琥酯可提高抗氧化物質含量，改善機體氧化應激。提示抑制氧化應激可能是青蒿琥酯對慶大霉素誘導犬腎衰發揮保護作用的主要機制之一。此外，與炎癥有關的代謝物花生四烯酸和棕櫚酸[18-19]，在慶大霉素誘導腎衰竭犬的尿液中含量升高，而給予青蒿琥酯治療后降低，這說明青蒿琥酯可以改善慶大霉素誘導腎衰竭時發生的炎癥反應。

綜上所述，慶大霉素誘導犬腎衰竭后體內一系列代謝途徑發生紊亂和代謝物發生改變，而給予青蒿琥酯干預后，腎衰竭犬的腎功能得到改善，可能與青蒿琥酯調節體內脂代謝、氨基酸代謝和能量代謝等通路有關。

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