新型鵝星狀病毒一步法RT-PCR檢測方法的建立與應用

肖亦辰 楊穎 馬平 趙冬敏 章麗嬌 劉青濤 楊婧 李銀 劉宇卓 韓凱凱 黃欣梅

摘要：新型鵝星狀病毒（goose astrovirus，GoAstV）感染引起的鵝痛風病，是近年嚴重危害我國養鵝業的傳染病之一，給我國養鵝產業造成嚴重經濟損失，快速準確診斷有助于更好地防控該病。為了建立一種鑒定新型GoAstV的一步法RT-PCR方法，根據新型GoAstV ORF2基因序列設計特異性引物，構建質粒標準品，并對引物用量和退火溫度等反應體系和條件進行了優化。結果表明，該方法能特異性擴增新型GoAstV 512 bp基因片段，其他鵝常見病毒性病原擴增結果均為陰性，具有較高的特異性。敏感性試驗結果提示，最小檢測限量達4.54×102 拷貝/μL。此外，該方法重復性良好，應用所建立的方法對新型GoAstV臨床樣品進行檢測，102份鵝泄殖腔拭子的陽性率為46.08%，24份痛風癥狀患病鵝內臟樣本陽性率為91.70%。本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復性，且操作簡便、經濟、快速，可用于新型GoAstV的臨床鑒別診斷和流行病學調查。

關鍵詞：新型鵝星狀病毒;一步法RT-PCR;鑒別診斷;鵝痛風病;敏感性試驗;臨床樣品檢測

中圖分類號：S855.3 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0142-05

收稿日期：2021-05-06

基金項目：橫向課題“雛鵝痛風病因確定和防控方法初探”。

作者簡介：肖亦辰（1998—），女，陜西西安人，碩士研究生，主要從事家禽疫病防控研究。E-mail：1457747114@qq.com。

通信作者：黃欣梅，博士，副研究員，主要從事家禽疫病防控研究。E-mail：hxmrene@126.com。

2016年以來，我國東部主要養鵝地區暴發一種以內臟痛風為主要特征的急性傳染病，給養鵝產業造成巨大經濟損失[1-2]。該病主要影響21日齡以內雛鵝，患病雛鵝表現為精神沉郁、食欲減退、腹瀉、四肢癱瘓，剖檢可見心臟、肝臟、腎臟等內臟器官表面、胸腹膜及關節腔內存在大量白色尿酸鹽沉積，死亡率為20%～50%。通過病原分離和動物回歸試驗，確定該病是由一種新型鵝星狀病毒（goose astrovirus，GoAstV）感染引起。基因序列分析結果表明，近年引起鵝痛風的鵝星狀病毒毒株（GD、AHQJ18、SDPY、JSHA和SD01）與以往從雞、火雞、鴨和鵝等家禽體內分離的禽星狀病毒的基因組同源性為49.5%～67.7%，編碼衣殼蛋白的ORF2基因核苷酸序列同源性僅為41.0%～59.0%，遺傳距離較遠，形成獨立的進化分支[3-7]。

目前，尚無有效疫苗和藥物預防或治療新型GoAstV引起的鵝痛風病癥。因此，早發現和準確診斷是預防該病流行和傳播的重要手段。另外，含高蛋白的飼料引起的蛋白質代謝障礙、藥物中毒引起的腎臟損傷也會導致血液中尿酸水平升高，引起鵝的痛風，需要注意與新型GoAstV感染引起的痛風鑒別診斷。經典的病毒分離及血清學診斷方法雖準確可靠，但存在費時、費力及對實驗室條件和生物安全性要求高等缺點，無法滿足臨床診斷的需要。目前，已有文獻報道檢測新型GoAstV的熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）方法[8-9]。盡管RT-PCR方法的靈敏度不如qRT-PCR，但RT-PCR方法擴增的片段較長，經測序后可用于基因型的確定和遺傳進化分析，可廣泛用于新型GoAstV的檢測和流行病學調查。一步法RT-PCR檢測方法將反轉錄和PCR擴增反應合并在一個反應管中一步完成，減少中間環節引入污染源的風險，不但節省時間，還可提高檢測準確率。本研究根據新型GoAstV ORF2基因序列設計特異性引物，優化反應條件，建立了準確、靈敏、快速的新型GoAstV一步法RT-PCR檢測方法，對新型GoAstV感染的快速診斷及有效防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

新型鵝星狀病毒AHQJ18株、坦布蘇病毒JS804株（TMUV）、鵝細小病毒（GPV）、H9N2亞型禽流感病毒（H9 AIV）、鵝副黏病毒（GPMV）和雞肝癌細胞系（LMH）等由江蘇省農業科學院獸醫研究所保存。

1.2 試劑

限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ，購自寶生物工程（大連）有限公司;pEASY-T1載體，購自北京全式金生物技術有限公司;DNA/RNA提取試劑盒、小量提取質粒試劑盒、膠回收試劑盒等，購自愛思進生物技術（杭州）有限公司;一步法RT-PCR試劑盒、DNA Marker、DH5α感受態細胞等，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank已發表的新型GoAstV ORF2基因序列，應用 Primer Premier 5.0 軟件設計了1 對檢測引物，擴增片段長度為512 bp，上游引物為PF：5′-TCCACCGAACACGCCACTA-3′，下游引物為PR：5′-AGCCGATTCCTGAGTTCCGTT-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 質粒標準品的構建

取200 μL新型GoAstV在LMH細胞上的培養物，采用RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，使用特異性引物PF和PR進行RT-PCR擴增新型GoAstV ORF2基因部分片段，回收純化PCR產物，克隆至pEASY-T1載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提取質粒，用限制性內切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ進行雙酶切鑒定，陽性質粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定。序列正確的陽性重組質粒即為質粒標準品，檢測質粒濃度并計算質粒拷貝數。

1.5 一步法RT-PCR反應體系及條件的優化

1.5.1 引物濃度優化 以新型GoAstV基因組RNA為模板，在0.2 mL PCR管中加入以下反應組分：2×one step mix 12.5 μL，Enzyme mix 1.25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）設置5個梯度，各分別加入0.1 μL、0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL和2.0 μL，模板RNA 2.0 μL，無RNase 雙蒸水加至總體積為25 μL，混勻，瞬時離心后置于PCR儀中。反應程序為：50 ℃ 反轉錄 30 min;94 ℃ 預變性 3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30個循環;最后72 ℃延伸7 min。反應完成后，取10 μL產物進行瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測。

1.5.2 退火溫度優化 篩選出最佳引物使用量后，固定反應體系及其他反應條件，對退火溫度進行優化。設置50、52、54、56、58、60 ℃ 6個梯度退火溫度，進行RT-PCR擴增。反應完成后，取10 μL產物進行瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測。

1.6 特異性試驗

取新型GoAstV細胞培養物、TMUV、GPV、H9 AIV和GPMV，分別提取RNA或DNA，同時設置空白LMH細胞和生理鹽水為陰性對照，用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法進行擴增，以評價該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

將測算好質粒拷貝數的質粒標準品進行10倍倍比稀釋，取4.54×108～4.54×100 拷貝/μL 9個濃度梯度作為模板，采用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法進行擴增，以評價該檢測方法的敏感性。

1.8 重復性試驗

采用建立的一步法RT-PCR方法對4 份新型GoAstV陽性樣品及正常LMH細胞進行3次重復檢測，以評估該方法的重復性和穩定性。

1.9 臨床樣品的檢測

對2020年6—9月間江蘇常州金壇、沭陽地區102份16日齡左右揚州白鵝泄殖腔拭子樣本，24份出現痛風癥狀患病鵝內臟樣本，采用本研究建立的檢測方法檢測新型GoAstV核酸，以評估該方法的臨床實用性。

2 結果與分析

2.1 質粒標準品的構建

分別提取新型GoAstV細胞培養物和正常LMH細胞RNA，以本研究設計的引物進行一步法RT-PCR擴增，進行瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測。由圖1可知，新型GoAstV細胞培養物在512 bp處可見單一的擴增條帶，與預期片段大小相符，而正常LMH細胞無擴增條帶。回收PCR產物，連接至克隆載體pEASY-T1，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒后進行雙酶切鑒定。由圖2可知，瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測顯示酶切片段為500 bp左右，與預期大小相符。測序結果顯示，所連片段與新型GoAstV AHQJ18株序列同源性為100%，表明新型GoAstV質粒標準品構建成功。采用核酸蛋白濃度檢測儀測定重組陽性質粒濃度為221 ng/μL，計算得出其拷貝數為 4.54×1010拷貝/μL。

2.2 一步法RT-PCR反應條件優化

2.2.1 引物濃度優化 固定其他反應條件不變，對上、下游引物（濃度10 μmol/L）設置5個體積梯度，分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μL，進行一步法 RT-PCR 擴增。由圖3可知，當上、下游引物（10 μmol/L）各加入體積為1.0 μL及以上時，即可獲得較高的擴增效率，條帶無顯著差異，因此確定引物最佳體積為1.0 μL。

2.2.2 退火溫度優化 固定一步法RT-PCR反應體系，加入上、下游引物各為1.0 μL，在RT-PCR擴增時設置6個退火溫度，分別是50、52、54、56、58、60 ℃，由圖4可知，退火溫度為54 ℃及以下時，目的條帶亮度均較強，差異不顯著，最終確定54 ℃為最佳退火溫度。

2.3 特異性試驗

利用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法對新型GoAstV細胞培養物、坦布蘇病毒（TMUV）、鵝細小病毒（GPV）、H9N2亞型禽流感病毒（H9 AIV）、鵝副黏病毒（GPMV），及空白LMH細胞和生理鹽水進行檢測。由圖5可知，該方法僅對新型GoAstV可擴增出長度為512 bp的目的基因，而對TMUV、GPV、H9 AIV、GPMV以及空白LMH細胞和生理鹽水的檢測結果均為陰性，表明本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法具有很好的特異性。

2.4 敏感性試驗

將新型GoAstV質粒標準品從4.54×108 拷貝/μL開始做10倍倍比稀釋至4.54×100 拷貝/μL，取每個稀釋度樣品分別作為模板進行一步法RT-PCR檢測。由圖6可知，該方法對新型GoAstV質粒標準品的最小檢出量為4.54×102 拷貝/μL，表明本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法具有

較高的敏感性。

2.5 重復性試驗

用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法對LMH正常細胞和4份新型GoAstV陽性樣品進行3次重復性檢驗。由圖7可知，3次重復檢測均出現相同的結果，陽性樣品均能擴增出相應條帶，而LMH正常細胞未出現擴增條帶，表明該方法具有良好的重復性和穩定性。

2.6 臨床樣品檢測

采用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR檢測方法對2020年6—9月間江蘇常州金壇、沭陽地區102份雛鵝泄殖腔拭子樣本和24份出現痛風癥狀患病鵝內臟樣本進行檢測（圖8）。檢測結果顯示，102份雛鵝泄殖腔拭子樣本中有47份為陽性，陽性率為46.08%;24份出現痛風癥狀患病鵝內臟樣本中有22份為陽性，陽性率為91.70%。對新型GoAstV陽性樣品的擴增條帶進行序列測定，證實目的條帶均為新型GoAstV ORF2基因的特異性片段，表明本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR檢測方法可有效地對臨床樣品中的新型GoAstV進行快速檢測，并具有良好的特異性和準確性。

3 討論

2016年以來，由新型鵝星狀病毒引起的以內臟痛風為主要特征的傳染病在我國東部商品鵝養殖地區暴發，并迅速傳播至山東、江蘇、安徽、河北、遼寧、福建及廣東等省，給我國養鵝產業造成了巨大的經濟損失。該病主要發生于21日齡以內雛鵝，患病雛鵝精神沉郁、采食量下降、腹瀉、四肢癱瘓，嚴重者死亡。剖檢可見肝臟、心臟、腎臟、胸腹膜以及翅、腿關節內出現嚴重的白色尿酸鹽沉積。作為一種新發傳染病，目前還沒有商品化疫苗和藥物可用以預防或治療該病，為最大程度減少養殖業損失，早發現和準確診斷顯得尤為重要。

RT-PCR技術是一種比較成熟的核酸擴增技術，具有快速、簡便、靈敏、特異性好和成本低等優點而被廣泛應用于細菌、病毒及寄生蟲等病原檢測。且該方法可與基因測序相結合，用于進一步的遺傳進化分析。新型GoAstV為RNA病毒，檢測時需先將病毒基因組RNA反轉錄為cDNA再進行PCR擴增，在此過程中易增加污染風險，造成假陽性。本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法減少了操作和加樣步驟，降低了引入污染源的風險，不但節省時間，還可提高檢測準確率。

本研究根據新型GoAstV ORF2基因序列設計1對特異性引物進行一步法RT-PCR擴增，獲得的特異性片段克隆入pEASY-T1載體構建質粒標準品。為獲得最佳檢測效果，對反應體系及反應條件進行優化，確定濃度為10 μmol/L的上、下游引物加入量為1.0 μL，最佳退火溫度為54 ℃。該方法僅對新型GoAstV可擴增出特異性條帶，對其他鵝常見病毒性病原及正常LMH細胞的擴增結果均為陰性，表明該方法具有很好的特異性。新型GoAstV一步法RT-PCR方法的最小檢測限量為4.54×102 拷貝/μL，具有較高的敏感性，該方法同時還具有良好的重復性。應用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法對臨床樣本進行檢測，結果顯示，102份鵝泄殖腔拭子的陽性率為46.08%，24份痛風癥狀患病鵝內臟樣本陽性率為91.70%。

因此，本研究建立的一步法RT-PCR方法可用于臨床鵝泄殖腔拭子和臟器樣本，及鵝胚和細胞培養物中新型GoAstV的檢測，靈敏度高，特異性強，并且快速準確、操作簡便，可作為新型GoAstV臨床鑒別診斷和流行病學調查的有力工具，為新型GoAstV感染的病原監測和有效防控提供技術支撐。

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