象皮生肌膏對糖尿病皮膚潰瘍修復的效果及其機理探究

雷宇　周忠志　蘭宏偉　王婷婷　黃新靈

[摘要]目的：研究象皮生肌膏對糖尿病模型大鼠皮膚潰瘍的修復作用，初步探究象皮生肌膏的作用機理。方法：選取80只清潔級雄性SD大鼠，隨機分成4組，正常組、模型組、貝復新組、象皮生肌膏組。各組分別在治療7、14 d后觀察各組皮膚潰瘍的修復狀況、檢測皮膚潰瘍組織中IL-6和TNF-α的表達情況。結果：象皮生肌膏組和貝復新組大鼠潰瘍創(chuàng)面的修復率較模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而且象皮生肌膏組修復率較貝復新組更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與正常組相比，模型組內IL-6、TNF-α的含量顯著增加（P<0.01）。與模型組相比，象皮生肌膏組及貝復新組創(chuàng)面組織勻漿中的IL-6、TNF-α的含量顯著下降（P<0.01），且象皮生肌膏組較貝復新組各指標含量下降更明顯（P<0.05）。結論：象皮生肌膏可以加快糖尿病皮膚潰瘍的修復，其作用機理可能是調控創(chuàng)面炎性因子IL-6、TNF-α的含量，減少炎性細胞的聚集，加快皮膚潰瘍創(chuàng)面的修復。

[關鍵詞]象皮生肌膏;糖尿病;皮膚潰瘍;炎癥因子;白細胞介素-6;腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號]R587.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）01-0089-03

Effect of Xiangpi Shengji Ointment on IL-6 and TNF-α in Diabetic Skin Ulcer

LEI Yu1，2，ZHOU Zhongzhi1，LAN Hongwei1，WANG Tingting1，HUANG Xinling1

（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China;2.College of Traditional Chinese Medicine，Changsha Medical University，Changsha 410219，Hunan，China）

Abstract： Objective To observe the effect of Xiangpi Shengji ointment on promoting the healing of diabetic skin ulcer and to study its effect on the inflammatory factors IL-6 and TNF-α in diabetic skin ulcer. Methods Selected 80 clean male SD rats，they were randomly divided into 4 groups：normal group， model group， Berfuxin group and Xiangpi Shengji ointment group. The repair status of skin ulcer and the expression of IL-6 and TNF-α in skin ulcer tissue were observed at 7 and 14 days after intervention. Results The repair rate of ulcer wound in Xiangpi Shengji ointment group and beifuxin group was significantly higher than that in model group （P<0.01）， and the repair rate in Xiangpi Shengji ointment group was higher than that in beifuxin group （P<0.05）. Compared with the normal group， IL-6 and TNF in the model group- α The content of was significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， IL-6 and TNF in the wound tissue homogenate of Xiangpi Shengji ointment group and beifuxin group- α The content of all indexes in Xiangpi Shengji ointment group decreased significantly （P<0.01）， and the content of all indexes in Xiangpi Shengji ointment group decreased more significantly than that in beifuxin group （P<0.05）. Conclusion Xiangpi Shengji ointment can accelerate the repair of diabetic skin ulcer. Its mechanism may be to regulate the content of IL-6 and TNF-α， reduce the aggregation of inflammatory cells， and promote the repair of skin ulcer.

Key words： xiangpi shengji ointment; diabetes; skin ulcer; flammatory cytokines; interleukin-6; tumor necrosis factor-α

糖尿病是臨床中常見的慢性疾病，患者除了有“三高一低”的常見癥狀外，常常合并一些皮膚潰瘍，且病情易反復，纏綿難愈，極大地降低了患者的生活質量。為尋求安全有效治療糖尿病導致的皮膚潰瘍的方法便成為臨床工作中亟需解決的問題。目前臨床上也有很多治療此疾病的藥物或方法，效果也各有優(yōu)劣。筆者醫(yī)院根據(jù)多年診治經驗研發(fā)了象皮生肌膏，此藥已通過藥監(jiān)局的審批，專用于治療各種皮膚潰瘍。筆者課題組多年研究結果證實[1-2]，象皮生肌膏能夠抗炎殺菌，減輕創(chuàng)面疼痛感，促進局部潰瘍的修復。本次研究構建糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型，進一步探究象皮生肌膏對模型大鼠局部皮膚創(chuàng)面的修復效果及其作用機理。具體結果如下。

1? 資料和方法

1.1 實驗動物：SD大鼠80只，雄性，清潔級，體重160～200 g。適應性飼養(yǎng)1周后實驗。

1.2 實驗藥物及試劑：①象皮生肌膏：象皮粉、當歸、醋龜甲、生地黃、生石膏、爐甘石、血余炭等;②陽性對照藥：貝復新（珠海億勝生物制藥有限公司，批準文號：國藥準字S20040001）;③造模藥：鏈脲佐菌素。大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒（上海仁捷生物科技公司，批號Jul 2017），大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（上海仁捷生物科技公司，批號Sep 2017），IL-6抗體（ab9324，abcam公司，批號GR35435-1）、TNF-α抗體（ab9579，abcam公司，批號GR35446-1）等。

1.3 實驗儀器：全自動酶標分析儀（BioTek公司）、5415R高速冷凍離心機（Eppendorf公司）、倒置顯微鏡（Olympus 公司）、電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、高速冷凍離心機（Eppendorf公司）、Western blot儀器（美國Bia-Rad公司）等。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備與分組：將80只清潔級雄性SD大鼠隨機分成4組：正常組、模型組、貝復新組、象皮生肌膏組。造模方式按照劉光源的方法構建糖尿病大鼠模型[3]——大鼠使用高脂乳劑以每只2 ml/d的劑量連續(xù)灌胃14 d，然后根據(jù)40 mg/kg的劑量給大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（Sterptozotocin，STZ）使大鼠隨機糖尿大于16.7 mmol/L。構建糖尿病模型成功的大鼠，參照文獻辦法[4]構建糖尿病皮膚潰瘍模型—先給予糖尿病大鼠麻醉，腹腔注射10%水合氯醛，根據(jù)每只大鼠3.5 ml/kg的劑量進行麻醉。再按照全層皮膚缺損標準，在背部兩側對稱部位剃毛形成2個4 cm×4 cm正方形裸皮區(qū)域。消毒裸皮區(qū)皮膚，隨后用打孔器在大鼠的皮膚消毒區(qū)域造2個半徑為0.5 cm的圓形創(chuàng)面，深至皮下，造成糖尿病全層皮膚缺損模型。

1.4.2 干預治療：正常組不予任何處理，正常飼養(yǎng)即可;模型組造模后不做任何干預;貝復新組造模后創(chuàng)面局部涂擦貝復新凝膠;象皮生肌膏組造模后創(chuàng)面局部涂擦象皮生肌膏。各組干預治療結束后，創(chuàng)面局部用紗布包扎，再用繃帶固定。每日治療1次，共治療14 d。治療結束后取創(chuàng)面組織進行檢測。

1.5 檢測方法

1.5.1 創(chuàng)面修復率：于治療7 d、14 d后，分別拍照記錄每組大鼠的皮膚創(chuàng)面修復狀況，并使用干凈透明的塑料薄膜覆蓋在每組大鼠的皮膚創(chuàng)面，再用鉛筆標記創(chuàng)面邊緣，記下每組大鼠的創(chuàng)面面積，計算出每組大鼠的創(chuàng)面修復率。創(chuàng)面修復率=（創(chuàng)面初始面積-創(chuàng)面面積）/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測各組創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α的含量：于治療7 d、14 d后，分別取每組大鼠的相同位置的創(chuàng)面組織，洗凈后剪碎，與預冷的生理鹽水以1：9的體積比例制備10%組織勻漿，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，用ELISA試劑盒檢測每組樣品上清液中IL-6、TNF-α的含量。將制備好的樣品放入酶標儀中，檢測每組樣本在波長450 nm的OD值，依照標準曲線計算出每組樣本中IL-6、TNF-α的含量。

1.5.3 Western Blot檢測各組創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α蛋白的表達：于治療14 d后，取各組大鼠的相同位置的創(chuàng)面組織，洗凈后剪碎，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書提取并測定蛋白濃度，采用Western Blot檢測每組大鼠樣品中IL-6、TNF-α蛋白表達量，其中IL-6、TNF-α，一抗按照1：1 000進行稀釋，二抗按照1：5 000進行稀釋。以GAPDH作為內參照蛋白，計算出每組樣本中IL-6、TNF-α蛋白的相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。重復3次。

1.6 統(tǒng)計學分析：SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料服從正態(tài)分布采用（xˉ±s）;多組間的比較，用單因素方差分析，若滿足方差齊性，用LSD檢驗進行多重比較，若方差不齊，則用Dunnet T3檢驗。不服從正態(tài)分布，采用比較秩和檢驗。P<0.05，有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面修復率比較：治療7 d和14 d后，查看每組大鼠皮膚創(chuàng)面修復情況，結果如圖1。然后計算各組大鼠局部皮膚創(chuàng)面的修復率：與模型組相比，象皮生肌膏組和貝復新組大鼠局部皮膚的創(chuàng)面修復率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且象皮生肌膏組較貝復新組修復率更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）結果如表1。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α含量比較：治療7 d和14 d后，使用ELISA檢測各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達水平。與正常組相比，模型組內IL-6、TNF-α的含量顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組相比，象皮生肌膏組及貝復新組創(chuàng)面組織勻漿中的IL-6、TNF-α的含量顯著下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），且象皮生肌膏組較貝復新組各指標含量下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果如表2～3。

2.3 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α蛋白表達量比較：治療后14 d，采用Western Blot檢測各組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥因子IL-6、TNF-α蛋白的相對表達量。與正常組相比，模型組內的IL-6、TNF-α蛋白相對表達量升高顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，象皮生肌膏組及貝復新組創(chuàng)面組織勻漿中的IL-6蛋白表達量明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結果如圖2。

3? 討論

中醫(yī)糖尿病又名“消渴病”，主要是上中下三焦陰虛，陰損及陽可導致臟腑陰陽失調，氣血兩虛，脾虛運化水液失常，化濕成痰;血液無氣推動運行緩慢，形成瘀血。此外，患者陰虛燥熱，日久體虛，若干熱熾盛，積毒成膿，加之正氣虛衰無以抗邪，則可發(fā)為癰疽癤瘡，即“瘡瘍”、“脫疽”、“筋疽”，臨床將其稱為糖尿病皮膚潰瘍。臨床治療糖尿病皮膚潰瘍以清熱解毒、養(yǎng)陰益氣、活血化瘀為主[5]。

象皮生肌膏是筆者醫(yī)院的院內制劑，方中象皮粉是君藥，主要有清熱解毒、化瘀止血的作用;生石膏、爐甘石是臣藥，可消腫止痛、斂瘡生肌;當歸、血余炭、生地黃、醋龜甲四味藥，作為佐藥，能夠補血活血、滋陰清熱、益氣補虛。大量的臨床實踐證明，象皮生肌膏治療糖尿病皮膚潰瘍，患者的治愈率較好。前期的研究結果也證實，象皮生肌膏有局部抗炎、殺菌，改善血液循環(huán)、加快創(chuàng)面修復的功效。本次實驗結果顯示，象皮生肌膏組治療7 d和14 d后，與模型組相比大鼠潰瘍局部創(chuàng)面修復的速率顯著增加（P<0.01），象皮生肌膏能增加糖尿病潰瘍的創(chuàng)面修復。

糖尿病是一種常見的慢性低炎癥性疾病，糖尿病潰瘍是其常見的并發(fā)癥，而潰瘍創(chuàng)面愈合慢的原因一直無法完全解釋[6]。創(chuàng)面愈合的過程非常復雜，包括創(chuàng)面炎癥反應、血管新生、基質形成和膠原合成，涉及多種可溶性介質之間的作用，如生長因子、細胞因子、趨化因子、細胞外基質和不同細胞因子之間的協(xié)調作用[7-8]。慢性持續(xù)性炎癥、細胞相關因子的缺少、肉芽組織的生成減少、血液循環(huán)受損等是創(chuàng)面難以愈合的主要原因。

炎癥反應是影響糖尿病皮膚創(chuàng)面潰瘍愈合的重要因素，其中IL-6和TNF-α是炎性細胞分泌的炎性因子，其高表達會使得各種炎癥細胞聚集于創(chuàng)面，導致發(fā)生劇烈的的炎性反應，使得創(chuàng)面的愈合時間加長。IL-6是由內皮細胞、單核細胞等分泌產生的一種多功能性炎性因子，它的過度表達可引起組織的修復能力下降。研究顯示[9]，IL-6與胰島素抵抗具有相關性，其表達程度與胰島素抵抗成負相關，即IL-6表達減少，組織創(chuàng)面的修復增加。TNF-α是由單核-巨噬細胞分泌的一種炎性因子，其正常表達時能夠調整人體的免疫系統(tǒng)，發(fā)揮免疫作用，而TNF-α的大量釋放反而會引起機體病理性損害，破壞機體的免疫平衡。當皮膚破潰時外周血單核細胞相對比較活躍，抗炎因子分泌明顯減少，而促炎細胞因子分泌增加，活化的單核細胞能夠分泌TNF-α，使TNF-α水平增加[10]，促進局部炎癥不斷加劇。在本實驗中，治療7 d和14 d后分別檢測創(chuàng)面組織中炎癥因子IL-6和TNF-α的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)模型組創(chuàng)面組織中的TNF-α、IL-6含量顯著增高，提示皮膚創(chuàng)面組織中有炎癥細胞聚焦，其炎癥反應處于過激狀態(tài);而與模型組比較，象皮生肌膏組創(chuàng)面治療7 d和14 d后創(chuàng)面愈合速率顯著升高（P<0.01），象皮生肌膏能明顯加快糖尿病性潰瘍大鼠創(chuàng)面修復速率;象皮生肌膏組組織創(chuàng)面中IL-6、TNF-α的含量均顯著低于模型組（P<0.01），提示象皮生肌膏能夠降低創(chuàng)面組織中炎癥細胞因子IL-6、TNF-α的含量，減輕創(chuàng)面局部的炎癥反應，并減輕創(chuàng)面組織炎性細胞的聚集。

綜上，象皮生肌膏可以促使糖尿病性潰瘍創(chuàng)面修復加快，其作用機理可能是調控創(chuàng)面炎性因子IL-6、TNF-α的含量，減輕創(chuàng)面組織炎性細胞的匯集，促進皮膚潰瘍創(chuàng)面的修復，但較為詳細的作用機理需要更深入的探討。

[參考文獻]

[1]馬樂，席建元，鮑秋羽.托里消毒飲聯(lián)合象皮生肌膏治療慢性皮膚潰瘍的臨床研究[J].中國醫(yī)藥導報，2020，17（25）：145-148.

[2]奉水華，熊武，黃新靈，等.象皮生肌膏聯(lián)合VSD對下肢慢性皮膚潰瘍術前傷口床準備的臨床價值[J].中國美容醫(yī)學，2017，26（9）：37-40.DOI：10.15909/j.cnki.cn61-1347/r.001936.

[3]劉光源，戴慕巍，田發(fā)明，等.高脂飼料配合鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病模型大鼠的椎間盤形態(tài)[J].中國組織工程研究，2017，21（12）：1883-1888.

[4]趙京禹，付小兵，雷永紅，等.大鼠小面積全層皮膚缺損創(chuàng)面模型的制備[J].感染.炎癥.修復，2008（1）：64.

[5]張春玲，陳露，趙偉，等.丹銀海綿對糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合的影響[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（3）：71-74.DOI：10.15909/j.cnki.cn61-1347/r.003642.

[6]Ben Moussa M，Khalfallah M，Boutiba Ben Boubaker I，et al.Bacteriological and therapeutic profile of diabetic foot infection：A prospective study of 100 patients[J].La Tunisie Me?dicale，2016，94（2）：95-101.

[7]Wang Q，Qian Z，Liu B，et al.In vitro and in vivo evaluation of new PRP antibacterial moisturizing dressings for infectious wound repair[J].J Biomat Sci-Polym E，2019，30（6）：462-485. DOI：10.1080/09205063.2019.1582270

[8]Palmieri B，Vadalà M，Laurino C.Review of the molecular mechanisms in wound healing：new therapeutic targets？[J].J Wound Care，2017，26（12）：765-775.DOI：10.12968/jowc.2017.26.12.765.

[9]Karmaker M，Sanyal S K，Sultana M，et al.Association of bacteria in diabetic and non-diabetic foot infection–An investigation in patients from Bangladesh[J].J Infec & Public Health，2016，9（3）：267-277.DOI：10.1016/j.jiph.2015.10.011

[10]Singh K，Agrawal N K，Gupta S K，et al.Increased expression of TLR9 associated with pro-inflammatory S100A8 and IL-8 in diabetic wounds could lead to unresolved inflammation in type 2 diabetes mellitus （T2DM） cases with impaired wound healing[J].J Diabetes Complications，2016，30（1）：99-108.DOI：10.1016/j.jdiacomp.2015.10.002

[收稿日期]2020-12-22

本文引用格式：雷宇，周忠志，蘭宏偉，等.象皮生肌膏對糖尿病皮膚潰瘍修復的效果及其機理探究[J].中國美容醫(yī)學，2022，31（1）：89-92.