MMP-2促進肌源性間充質干細胞成骨分化的實驗研究

朱忠勝，殷諾，張東，肖海軍，薛鋒

(上海市奉賢區中心醫院骨科，上海 201406)

多年來，臨床上治療大段骨缺損缺少理想的方法。而納米生物材料、3D打印生物材料、基因治療、外泌體組織工程等新型骨組織工程學的快速發展為大段骨缺損治療帶來了新的希望[1-4]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一組鋅與鈣離子依賴性的肽鏈內切酶家族，在干細胞遷移和腫瘤轉移行為過程中發揮重要的調節作用[5-8]，但其在干細胞成骨分化中的作用尚不明確。本課題組前期研究結果提示肌源性間充質干細胞具有良好的成骨分化能力和促進骨修復的作用[9]，同時發現MMP-2在肌肉異位骨化中高表達，在肌源性間充質干細胞抗凋亡實驗中發現了MMP-2存在顯著的表達變化，并且抑制MMP-2表達后肌源性間充質干細胞的細胞活力明顯降低，提示MMP-2在肌源性間充質干細胞成骨及骨修復過程中可能具有重要的調控作用。本研究采用大鼠肌肉原代分離出的肌源性間質干細胞，通過構建MMP-2過表達及干擾載體，觀察MMP-2對肌源性間充質干細胞成骨分化及鈣結節形成的影響。

1 資料與方法

1.1 材料 I型膠原酶(YEASEN)，胰蛋白酶(北京中杉金橋)，青-鏈霉素(杭州吉諾)，Dulbecco氏培養基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)/F12培養液(GIBICO)，胎牛血清(GIBICO)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(北京天根)，多聚賴氨酸(碧云天)，CD44/90/29/105抗體(Abcam)，CD106/45抗體(Abcam)，Runt相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)抗體(Abcam)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)抗體(Santacruz)，骨鈣素(osteocalcin，OCN)抗體(Abcam)，β-actin抗體(Abcam公司)，逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(TAKARA)，RNA提取試劑Trizol(Ambion)，逆轉錄試劑盒(TAKARA)，質粒DNA提取試劑盒(北京天根)，限制性內切酶(Thermo Fisher)，茜素紅染色試劑盒(Sigma)，成骨誘導液(Thermo Fisher)。流式細胞儀(BD)，倒置顯微鏡(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 肌源性間充質干細胞的原代分離培養及鑒定 (1)取4周雄性SD大鼠脫頸處死；(2)消毒后切取右后肢股四頭肌約2 g，剪成肉糜狀；(3)PBS液沖洗3次去除上清；加入2～3倍體積0.10% Ⅰ型膠原酶，置入37℃水浴消化40 min(其間吹打數次)；(4)離心，吸除上清，加入2～3倍體積的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA)，37℃水浴消化20 min(其間吹打數次)；(5)加入含20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12培養液2～3 mL終止消化，同上法離心5 min；(6)吸除上清，加入含20% FBS的DMEM/F12培養液重懸細胞，所得細胞懸液用100、200、400目濾網依次過濾，將濾液置入未經多聚賴氨酸處理的培養瓶中，使之貼壁；(7)1 h后將未貼壁的細胞轉入新的經多聚賴氨酸包被的培養皿中，繼續培養。4 d后首次換液，以后2～3 d換液1次；(8)待細胞生長達70%融合后，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1︰2比例進行傳代；(9)取傳達2代后培養的細胞進行流式檢測：CD90(+)、CD105(+)、CD44(-)、CD45(-)，檢測確定后進行傳代培養。

1.2.2 MMP-2過表達及干擾載體的構建 (1)過表達載體Plvx-IRES-ZsGreen1-MMP-2的構建：根據美國國家生物技術信息中心數據庫中MMP-2 (NM_031054.2)序列信息設計并合成PCR引物，上游為AATTCCTCGAGACTAGTTATGGAGGCACGATTGGTCTG，下游為ATCCGCGGCCGCTCTAGTCAGCAGCCCAGCCAGTC。以含目的基因MMP-2的cDNA為模板，進行PCR擴增MMP-2基因，再以目的基因PCR產物和Plvx-IRES-ZsGreen1載體進行酶切及回收，并進行質粒驗證；(2)干擾質粒Plvx-shRNA2-sh-MMP-2的構建：設計并合成引物，合成單鏈 DNA oligo，把片段1、片段2干粉溶解于退火緩沖液中(100 μL)，90℃，5 min，然后自然冷卻至室溫，使其復性成雙鏈。Plvx-shRNA2載體BamHI和EcoRI雙酶切及回收、連接轉化、質粒抽提，最后測序鑒定。

1.2.3 免疫蛋白印跡(western blot，WB) 檢測上調和下調MMP-2表達后肌源性間充質干細胞成骨分化標志蛋白(RUNX2、OCN、ALP)表達的影響。分別于第1天、第7天、第14天收集肌源性間充質干細胞，加入細胞裂解液，12 000 rpm，4℃離心5 min，提取上清液。常規電泳、轉膜，封閉，分別加入一抗RUNX2、OCN、ALP (1︰1 000)雜交。以β-actin為內參。

1.2.4 茜素紅染色 (1)收集經過質粒轉染的對數生長期的肌源性間充質干細胞，用胰酶消化1～2 min，在倒置顯微鏡下觀察消化后細胞的形態變化，當有少量細胞懸浮時棄掉消化液，加入2～4 mL培養液終止消化，吹打分散細胞；(2)用血球計數板計數，24孔板加入爬片，每孔2×104個細胞，設3個重復，根據實驗需要培養加入成骨誘導液第7天、第14天時進行染色；(3)在每個時間點先輕輕棄除培養液，PBS沖洗3次。加入95%酒精固定30 min；(4)將茜素紅染液用0.22 μm濾紙過濾，加入染液覆蓋住底孔，室溫染色放置5 min；(5)PBS漂洗3次。風干，甘油明膠封片；(6)顯微鏡觀察拍照。

1.3 統計學分析 應用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料組間比較采用獨立t檢驗或者方差分析，計數資料組間比較用Fisher確切概率法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肌源性間充質干細胞原代分離培養及鑒定 肌源性間充質干細胞的形態學觀察：取原代培養的細胞接種于培養皿后，分別于培養0 d、1 d、7 d鏡下觀察，鏡下可見大量大小不一的圓形細胞懸浮于培養液中。培養1d后開始有細胞貼壁生長，呈多邊形、梭形，分散在培養皿貼壁生長；培養7 d后細胞排列較整齊，融合成片生長，形態一致，呈長梭形，融合率達70%(見圖1)。肌源性間充質干細胞表面標記物檢測：流式細胞儀檢測結果顯示，第3代大鼠肌源性間充質干細胞表面標記物CD90、CD105陽性率均高于90%，而CD44、CD45陽性率均低于1%，這提示我們所分離得到的細胞即為具有干細胞特征的大鼠肌源性間充質干細胞(見圖2)。

圖1 培養0 d、1 d、7 d后肌源性間充質干細胞的形態特征(×100)

圖2 肌源性間充質干細胞原代分離培養的流式細胞鑒定

2.2 MMP-2過表達及干擾載體的構建及轉染成功的肌源性間充質干細胞 根據MMP-2的全長序列，設計3條相應的shRNA序列及相應的對照序列，分別為sh-MMP-2-1、sh-MMP-2-2和sh-MMP-2-3。WB實驗檢測結果提示sh-MMP-2-2對于MMP-2的表達干擾作用最好(見圖3a)，被選作為后續實驗中干擾MMP-2的shRNA序列；同時相較于對照組，MMP-2的過表達質粒轉染細胞后結果提示MMP-2的表達明顯上調，這對于后續研究MMP-2影響肌源性干細胞成骨分化及相關蛋白表達奠定了基礎(見圖3b)。

a sh-MMP-2明顯下調細胞中MMP-2的表達水平 b 過表達質粒明顯上調MMP-2的表達

2.3 MMP-2促進肌源性間充質干細胞的成骨基因的表達 WB檢測各時相肌源性間充質干細胞中成骨因子表達水平：轉染shRNA或者MMP-2的過表達質粒，干預肌源性間充質干細胞中MMP-2的表達后，繼續培養細胞，分別在第1天、第7天、第14天采用WB檢測細胞中成骨基因RUNX2、OCN、ALP的表達水平。結果與陰性對照組相比較，干擾MMP-2的表達后在第1天、第7天、第14天，RUNX2、OCN、ALP的表達明顯下調(P值分別為0.037、0.038、0.033，均<0.05)，而過表達MMP-2后RUNX2、OCN、ALP的表達隨之明顯上調(P值分別為0.02、0.03、0.01，均<0.05)，這提示MMP-2可能通過促進成骨分化相關蛋白RUNX2、OCN、ALP的表達促進肌源性間充質干細胞的成骨過程，具體分子機制有待進一步闡明(見圖4)。

a 培養1 d b 培養7 d c 培養14 d

2.4 MMP-2促進肌源性間充質干細胞鈣結節的形成 對肌源性間充質干細胞分別轉染MMP-2過表達質粒或shRNA后，于第7天和第14天進行茜素紅染色，結果顯示對照組、過表達組、干擾組細胞在培養第7天時組間茜素紅染色差異不大(P>0.05)；但是，在培養14 d時過表達組的茜素紅染色鈣結節最多，干擾組最少，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05，見圖5)。

圖5 茜素紅染色檢測鈣結節形成情況(茜素紅染色，×100)

3 討 論

3.1 肌源性間充質干細胞的作用 肌源性間充質干細胞具有一般干細胞的特點，可以自我更新、繁殖產生更多的干細胞，同時也可以分化成各種各樣的具有特定功能的細胞，既可以向成肌細胞方向分化，也可向成骨細胞方向分化[10]。肌源性間充質干細胞作為組織工程的種子細胞，來源廣，易獲取，既沒有胚胎干細胞的倫理問題，也沒有骨髓間充質干細胞(bone marrow-mesenchymal stem cells，BM-MSCs)的來源受限問題，因為成年人肌肉組織約占體重的35%～45%[11-12]。眾多的研究表明，肌源性干細胞能夠分化成軟骨和骨，可以直接參與骨折愈合。肌源性干細胞在與骨膜損傷更嚴重的骨折中的作用尤為重要[13-16]。研究指出肌源性間充質干細胞不僅能直接參與骨組織的修復，同樣也可以通過BM-MSCs類似的作用促使旁分泌因子的分泌影響骨修復[17]。

3.2 MMP的作用 MMP是一組鋅與鈣離子依賴性的肽鏈內切酶家族。家族所有成員具有一些共同的氨基酸序列和結構域，通過其某個區的增減修飾而形成不同的MMP。根據其結構和作用底物不同可分為6大類：膠原酶、明膠酶、溶基質素、溶間質素、膜型MMP和其他MMPs[5]。它們的生物學功能主要是降解細胞外基質蛋白質。在多種組織和細胞中均有表達，腫瘤細胞、上皮細胞、內皮細胞、角質細胞、骨骼肌細胞、神經細胞、成纖維細胞等都表達不同類別的MMPs。在許多正常的生理過程，如胚胎發育、形態形成、再生與組織愈合，它們都發揮著重要的功能[6-7]。它們也參與許多病理過程，如關節炎、癌癥以及心血管疾病等[18-20]。

已有研究報道多種MMPs在人BM-MSCs中表達，干細胞MMPs的表達變化影響干細胞微環境，在干細胞遷移和多種分化行為過程中起著重要調節作用[21]。BM-MSCs向成骨分化過程中表達包括MMP-2、細胞膜型1-MMP(membrane type 1 metalloprotease，MT1-MMP)在內的多種MMPs。Schneider等[22]證明臍帶來源的間充質干細胞在分化為成骨細胞的過程中表達MMP-1和MMP-2，這些MMPs在骨代謝和骨形成過程中可能起重要作用。

3.3 MMP-2促進成骨的作用及意義 本實驗采用原代培養方法分離出肌源性間充質干細胞，通過構建MMP-2過表達和干擾載體，上調和下調肌源性間充質干細胞中的MMP-2表達，進而檢測肌源性間充質干細胞成骨相關基因的表達變化及其對成骨分化的影響。研究發現MMP-2能夠促進肌源性間充質干細胞的成骨分化，同時能夠促進鈣結節的形成，從一定程度上提示MMP-2在干細胞成骨分化中可能發揮重要作用。骨骼肌來源的細胞應用于骨和軟骨組織修復和再生的研究已經取得了長足的進展，由于骨骼肌獲得方便及實用性，將有助于骨折及大段骨缺損修復的臨床研究[23]，但其具體分子調控機制有待進一步研究。伴隨著骨組織工程技術的不斷成熟，可能為其廣泛的臨床應用提供一定的理論支撐。