電刺激小腦外側核對內皮素-1誘導運動皮層缺血大鼠模型局部場電位的影響*

施國榮 劉婷婷 田 欣 祝自新 鄭文榮 王宇峰 孫芳玲 王 文,3

(1.首都醫科大學宣武醫院實驗動物室，北京 100053)(2.北京市老年病醫療研究中心，北京 100053)(3.北京腦重大疾病研究院腦卒中研究所，北京 100053)

缺血性卒中是世界范圍內成人殘疾和死亡的主要原因之一[1]。大多數幸存患者由于神經功能缺陷和障礙，導致生活質量的降低。根據流行病學統計數據，73.88%的首次卒中幸存者和55.75%的慢性卒中患者出現上肢運動障礙[2]。卒中的康復治療是一個復雜的過程，受限于對影響腦功能重塑機制的認識不足以及我國康復醫學發展起步較晚，目前亟需有效的卒中臨床康復治療手段。

作為基于腦的物理刺激干預，腦深部電刺激(deep brain stimulation, DBS)可能為卒中患者尤其是有嚴重運動障礙的患者，提供功能恢復的機會[3]。目前大多數卒中后遺癥的DBS治療主要集中在神經性疼痛，只有少數病例報告使用DBS治療運動障礙[4-5]。然而，這些有限的數據表明，腦深部電刺激有可能改善卒中后的運動功能。最近的研究表明，用電或光遺傳學方法刺激小腦外側核可以促進卒中后運動功能的恢復[6]。本課題組前期研究也發現運動皮層缺血1 周或1 個月后電刺激小腦外側核(lateral cerebellar nucleus，LCN)DBS可促進梗死側SVZ區內源性神經干細胞增殖，進而改善大鼠的運動功能，減少梗死體積[7]。

電生理技術的應用為神經系統中的細胞活動提供客觀的數據。其中在體大腦局部場電位(local field potential，LFP)記錄通過記錄大群神經細胞活性，監測距離記錄電極最近的空間加權低頻活動，體現神經網絡中高度動態信息流[8]。因此LFP記錄已被用于識別神經疾病的病理變化，檢測進行性神經障礙的損傷程度，甚至可能提供與外顯行為效應相對應的生理標志物，同時也為在體評估針對神經細胞活性的治療手段提供客觀準確的方法[9-10]。本實驗通過在體記錄大鼠大腦皮層的神經電生理信號，觀察內皮素-1(endothelin 1,ET-1)誘導局灶性腦缺血大鼠模型皮層LFP的變化，探討LCN DBS治療對皮層神經元活動的影響，為LCN DBS再生修復治療卒中提供了新的客觀證據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑：藥物與試劑內皮素-1(默克公司)、1.27 mm 2×40 p排針(深圳市連譽德科技有限公司)、1.27 mm 2×40 p排母(深圳市連譽德科技有限公司)、外徑0.9 mm特氟龍鍍銀導線(上海鴻鵬電線電纜有限公司)、內徑0.076 mm外徑0.114 mm 特富龍絕緣鎢絲(Plexon公司)。

1.1.2實驗動物：SPF級別260～280 g雄性SD大鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司提供。動物生產許可證【SCXK(京)2021-0008】，合格證號【11804700015271】。術前過夜禁食不禁水。采用內皮素-1注射大腦皮層誘導局灶性缺血模型，術后休息一周，第7 天安裝電極，電極安裝完成后隨機分為模型組和DBS組，每組3 只。

1.2 方法

1.2.1模型制備：采用ET-1定點注射大鼠右側皮層誘導局灶性腦缺血模型。雄性大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(1%戊巴比妥鈉溶于無菌0.9%氯化鈉溶液，43 mg/kg)后，使用立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)固定。碘伏消毒大鼠頭部中線處皮膚，大鼠中線做切口以暴露顱骨，并在相對于前囟的如下坐標處鉆3個小孔：(1)AP(anterior-posterior,前后側)=-1.0 mm, ML(medial-lateral, 內外側)=-2.5 mm, DV(dorso-ventral,背腹側)=-2.3 mm;(2)AP= +1.0 mm, ML=-2.5 mm, DV=-2.3 mm;(3)AP= +3.0 mm, ML=-2.5 mm, DV=-2.3 mm。ET-1溶于無菌0.9%氯化鈉溶液中，每孔注入800 pmol/2 μL。術后將大鼠置于37 ℃的加熱板上，待從麻醉中醒來，運送回籠子里。

1.2.2小腦外側核深部電刺激：局灶性腦缺血后第7 天，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠(1%戊巴比妥鈉溶于無菌0.9%氯化鈉溶液，43 mg/kg)，然后固定在立體定位框架上。碘伏消毒大鼠頭部中線處皮膚，大鼠中線做切口以暴露顱骨，在大鼠的小腦外側核進行打孔，相對于前囟的坐標為：AP=-11.0 mm, ML=+3.6 mm, DV=-6.3 mm安裝刺激電極；在大鼠的皮層上方打孔，相對于前囟的坐標為(1)AP=-2 mm, ML=+3.0 mm，DV=-1 mm(2)AP=-2 mm, ML=-3.0 mm，DV=-1 mm安裝記錄電極，(3)AP=-8 mm, ML=-2 mm，DV=0 mm安裝基線和地線。安裝完成后用牙托水泥進行固定[11]。DBS組每天給予8 h的30 Hz電刺激，連續14 d。

1.2.3電生理記錄：分別在缺血模型后第7和21天，進行誘導局部場電位記錄。戊巴比妥鈉麻醉大鼠后(1%戊巴比妥鈉溶于無菌0.9%氯化鈉溶液，43 mg/kg)，刺激大鼠的左前肢10 s一次，重復30 次(10 hz，2.5 mA，3 次脈沖電流，每次脈沖刺激包括：刺激2 ms，延遲32 ms，刺激2 ms，延遲64 ms),同時采用OmniPlex在體多通道記錄系統(Plexon公司)連續記錄30次脈沖刺激的局部場電位信號。從第7次刺激開始到第30 次的每次刺激之后的0.5～9 s進行分析。同時分析了每個頻帶信號的患側-健側功率比：Theta(3～10 Hz), Alpha(8～14 Hz), Beta-1(15～20 Hz), Beta-2(20～35 Hz)和Gamma(35～90 Hz)。

2 結果

2.1 LCN DBS 對誘發皮層LFP平均功率的影響

ET-1定點注射誘導皮層缺血7和21 d，患側皮層的誘發神經元活性顯著降低，約為健側皮層的37.8%和41.5%(P<0.001，P<0.01)(圖1)。給予14 d LCN DBS治療后，患側皮層平均功率雖然低于健側水平(P<0.001)，但比刺激前顯著增加86.8%(P<0.001)，比模型組21 d的患側平均功率增加79.2%。給予14 d LCN DBS治療后，刺激后健側相較于刺激前也有所增加(P<0.01)(圖2)。

圖1 缺血后7、21 d模型組和DBS組的代表性局部場電位圖

注：*P <0.01，**P<0.001

2.2 LCN DBS 對不同頻帶LFP功率的影響

模型組各波段的患側/健側功率比值缺血后21 d與缺血7 d相比沒有統計學差異(P>0.05)。而DBS治療后，Theta波、Alpha波和Beta-1波患側/健側功率比值與治療前相比均有顯著提高(P<0.05，P<0.01)，表明DBS對這些波段神經興奮性有改善作用。Beta-2波和Gamma波組間無顯著差異，表明DBS對其無明顯作用(圖3)。

注：A.Theta波(3～10 Hz)；B.Alpha波(8～14 Hz)；C.Beta-1波(15～20 Hz)；D.Beta-2波(20～35 Hz)；E.Gamma波(35～90 Hz),*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

DBS是一種新型神經調節方式，需要在腦實質中植入刺激電極，通過所連接的脈沖發生器調節，將電脈沖傳遞到目標大腦結構，用來調節局部和遠程功能失調的大腦回路[11]。DBS的電刺激傳遞是可逆的和可編程的，刺激模式可以是連續的或間歇的，刺激參數(頻率、脈寬、電壓)可調，刺激位點范圍廣泛，幾乎在大腦的任何地方使用[3]。因此，DBS目前作為一種安全有效的運動障礙治療方法，在帕金森病、特發性震顫和肌張力障礙等疾病治療中有很好的臨床應用[12]。研究表明，DBS對減輕卒中后疼痛、肌張力障礙、痙攣等也有較好的效果[12]。但是目前DBS在改善卒中運動功能方面的研究較少。另外，DBS刺激靶點的選擇對于疾病至關重要。神經影像學和電生理學研究已經證實小腦-丘腦-皮層(dentate thalamo cortical,DTC)通路在運動恢復中的重要作用[13]。小腦外側核作為該興奮性通路的起點，將興奮性神經輸出經丘腦發送到對側運動皮層區，包括初級運動區和腹側前運動皮層，以及非運動區背外側前額葉皮層[13]。有研究發現對LCN進行光遺傳學刺激可以持續性恢復卒中后運動功能[6]。最近的一項回顧性研究發現有13 位卒中后運動障礙患者在LCN DBS治療后癥狀有明顯的改善[14]。我們前期研究發現腦缺血后給予30 Hz LCN DBS可促進SVZ內源性神經發生改善大鼠運動功能，也進一步證實LCN很有可能作為卒中DBS治療改善運動功能的靶點[7]。

電生理研究在DBS治療中評價神經元功能至關重要。腦內LFP通過記錄電極周圍群體神經元放電活動-突觸跨膜電流產生的細胞場勢，來直觀衡量大腦神經元活性，反映神經網絡中高度動態的信息流動，為疾病機制和認知過程提供更有價值的見解[15]。本研究采用電生理采集系統記錄大鼠雙側運動皮層LFP信號，考察電刺激小腦外側核對皮層神經元興奮性的影響。有研究顯示ET-1誘導局灶性腦缺血損傷后，梗死周圍區域的平均神經元活動衰減約50%[16]。本研究結果顯示，在ET-1注射誘導局灶性腦缺血后7和21 d，患側的LFP顯著低于健側，提示局灶性腦缺血導致神經元活動衰減，與之前報道一致。給予對側LCN DBS 刺激，患側皮層LFP顯著升高，表明LCN DBS具有增強神經元活性的作用。LCN DBS也導致電刺激同側運動皮層LFP的升高，表明電刺激激活DTC通路興奮性傳導在大腦半球之間存在交聯。神經元活動復雜，具有頻譜特異性，不同的震蕩頻率具有不同的功能。因而我們用基于不同頻帶來分析LFP結果，將能更好地理解DBS治療的機制。Theta波(3～10 Hz)和alpha波(8～14 Hz)都屬于低頻波段，稱為低頻波(low frequency,LF)[16]。LF通常被認為與認知和情緒有關，包括沖突判斷、經濟決策、沖動控制、獎勵相關加工、記憶功能、注意和意識、模糊感知辨別、言語生成和抑郁[17]。此外，LF也被發現與運動障礙相關[18]。本研究也發現LCN DBS刺激后LF的功率上升，這與運動功能改善相一致。Beta波一般被劃分為高Beta波(Beta-1，15～20 Hz)和低Beta波(Beta-2，20～35 Hz)。Beta-1波通常被認為與步態障礙有關，本研究發現LCN DBS刺激后Beta-1得到改善[19]。Beta-2波通常被認為與力量有關，LCN DBS刺激則對其沒有作用[20-22]。Gamma波通常被認為與神經元的異常放電有關，在本研究中也對LCN DBS不敏感[23]。我們前期證實LCN DBS能增加面條矩陣抓取任務中大鼠前肢抓取面條數量和擴大在矩陣的分布，減少不規則水平梯子行走實驗和網格漏空實驗中錯誤步數，增強內源性神經干細胞增殖和分化，縮小梗死體積[7]。本研究中LCN DBS對LFP不同波段功率的影響與改善運動功能的作用相吻合，為LCN DBS治療腦缺血后運動功能障礙提供客觀證據，同時該研究也為運動功能的客觀評價提供可靠的方法。

綜上可見，ET-1定點注射誘導局灶性腦缺血后，皮層局部場電位降低，神經元活動減弱，而LCN DBS激活DTC通路對皮層神經元的興奮性有改善作用。結合前期行為學研究和組化研究結果，LCN DBS很可能成為治療卒中運動功能障礙的有效方法。LFP只能采集局部皮層下神經元電活動的情況，我們后續將采用磁共振成像分析等技術進一步完善神經纖維追蹤，構建LCN DBS治療的神經網絡圖譜，更好地理解DBS改善運動功能的機制。