膽固醇結石小鼠模型的研究進展及致石飼料的設計應用*

蘇永騰 葛全金 吳小馬

(1.江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司，南京 210000)(2.南京農業大學，南京 210095)

膽結石是一種常見的肝膽疾病[1]，在美國，12%的居民深受膽結石的危害和困擾，在歐洲，膽結石患者也超過了人群的10%，在中國等亞洲經濟新興國家，隨著社會經濟的發展和飲食結構的變化，膽結石患者也在逐年增加，患病率逐漸接近西方社會[2]。可見，這種古老而常見的疾病給全世界人類的身體健康、社會經濟、國家財政都帶來了嚴重的影響和負擔[2-3]。實驗動物膽固醇結石模型的建立對研究人類結石的形成機制和對癥治療有著良好的指導意義，諸多文獻報道采用致石飼料可以誘導出小鼠等實驗動物的膽固醇結石模型，但是報道的致石飼料配方之間有差異、造模成功率也程度不一，小鼠品系的選擇、造模初始周齡和造模周期等也因不同的研究目的而不同[4-7]。本文通過綜述小鼠膽結石造模的研究進展以及致石飼料設計特點和應用現狀，旨在為膽結石癥的研究工作提供借鑒。

1 膽固醇結石

1.1 膽結石的定義與分類

膽結石又稱為膽石癥，是一種常見的、發病率高的膽道系統發生結石并可能引起腹痛、黃疸、發熱等臨床癥狀的疾病[7]。膽結石的命名與分類一般根據不同的成分、不同的成石部位等來進行。結石的檢測方法一般有X線衍射分析法、磁共振譜(HNMR 譜)分類法、紅外光譜分類法、電子自旋共振(ESR)譜分析法等[1]。通過化學分析法分析膽結石中膽固醇含量，將膽固醇含量≥70%的結石歸為膽固醇型結石，將膽固醇含量≤30%的結石歸為膽色素型結石，介于二者之間的(30%～70%)歸為混合型結石，此方法現為教科書中經典的膽結石成分分類法[5]。因此，由于膽色素代謝和膽固醇代謝的交織，膽固醇性結石當中往往也有比較多的膽色素，而膽色素性結石當中往往也有比較多的膽固醇出現[8]。

1.2 膽固醇結石的成因

膽固醇結石的形成是由復雜的遺傳基因調控和機體內外環境因素相互作用導致的結果[2,9-10]。研究者猜想膽汁中可能同時含有促核因子和抗核因子，其含量的不平衡可能導致膽固醇快速結晶從而形成結石，但這一說法仍需要更多的研究來證實[2,12-14]。黏蛋白是第一個被發現的促進膽固醇結晶成石的蛋白分子，還有許多其他蛋白也被認為是影響膽汁中膽固醇結晶的促核因子或抗核因子，但它們作用機制仍不清楚[2,15-17]。2010年，有研究首次提出了膽結石病的五種致病因素，分別為：①遺傳因素和Lith家族基因；②肝膽固醇的高量分泌，導致膽固醇過飽和(即高膽固醇飽和指數)；③膽固醇的結晶與晶體的生長(相變)；④膽囊運動受阻；⑤腸道因素(包括膽固醇的吸收以及腸道微生物菌群的變化等)[4]。遺傳基因因素調控肝膽固醇持續性的高分泌，導致膽固醇過飽和，加速膽固醇結晶，而膽囊運動功能受損則引起了黏蛋白凝膠的產生并積累，促進膽泥的形成和微小結石的生長，這些改變破壞了膽汁酸肝腸循環系統的平衡，導致膽汁酸池發生了變化，同時，腸道微生物群的異常也會影響肝、腸道和膽汁中膽固醇和膽汁酸的代謝，并損害膽囊的排空和再灌注。因此，上述五種因素是通過交織互作、相互影響來引起機體膽固醇結石的形成[4,18-20](圖1)。

圖1 膽固醇結石病的五種致病因素及其交織互作示意圖

2 膽固醇結石小鼠模型的建模研究

2.1 膽固醇結石實驗動物模型研究

膽固醇結石實驗動物模型可以幫助研究者深入研究該疾病的病理生理學，有助于開發出創新有效的治療方法。膽固醇結石模型的造模有幾種方法：如感染法、膽汁淤積法、藥物注射法(林可霉素)、基因編輯、飲食誘導等[2,21-23]。在飲食誘導方面，從20世紀50年代開始，研究者就通過給倉鼠、小鼠、豚鼠、松鼠、土撥鼠、兔子和猴子等實驗動物喂養數周到幾個月的致石飼料成功建立了膽固醇結石模型，利用模型研究膽結石疾病的發病機制[2]。通過文獻調查研究發現，用于膽結石模型建立的實驗動物中，小鼠排在第二位，使用頻率比較高的有豚鼠(40.98%)、小鼠(27.87%)、兔(26.22%)、犬(1.64%)、金黃地鼠(1.64%)和樹鼩(1.64%)(表1)[24]。

表1 不同膽固醇結石實驗動物模型及其使用比例

2.2 膽固醇結石小鼠模型的建模研究

小鼠是良好的膽固醇結石造模實驗動物[24-25]。給8種近交系小鼠飼喂致石飼料10周后觀察到小鼠出現膽結石，成石率0%～100%[26]；有研究進一步確認了小鼠在致石飼料的喂養下，膽結石患病率存在品系和性別差異[27-28]；有研究發現基因編輯小鼠在致石飼料的短期喂養下很快就出現了膽固醇結石[29]。這些研究結果表明，C57BL/6品系小鼠最適合用于膽結石造模，在飲食誘導的條件下成石時間較快，特別是在伴隨一些調控基因缺失時，這些研究分析為小鼠膽結石造模研究打下了良好基礎(表2)。

表2 不同品系、性別、處理的小鼠膽固醇結石造模

近年來小鼠膽結石模型使用頻率大為增加，這是因為小鼠造模方法簡單，膽固醇結石形成速度快，小鼠對致石飼料敏感，膽汁量、結石數量較多且血液和組織標本的提取工作相對其他動物容易等。至20世紀90年代，第一個與膽結石相關的基因Lith1在近交系C57L/J小鼠中得以鑒定，隨后，在小鼠結石造模研究中發現了膽結石易感鼠C57L/J和抗膽石癥鼠AKR/J之間成石的差異是由兩個Lith基因決定，即Lith1和Lith2[30]。之后研究者通過更多的近交系小鼠膽結石模型研究發現了更多的Lith基因(Lith1～Lith25)參與到膽結石的成石調控中來[31]。這些成果為研究人類結石基因和探索人類膽石形成的機制奠定了良好的基礎。

3 致石飼料在小鼠模型的應用現狀

研究發現，腸道膽固醇的高效率吸收和高膽固醇飲食方式是小鼠膽固醇結石的兩個重要成因[2]。腸道吸收膽固醇后運送至肝并分泌于膽汁的這一代謝通路一旦受到影響，膽固醇就容易出現結晶并導致膽結石的形成，如膽固醇的過量攝入和酯化、腸細胞內脂質轉運受損、乳糜微粒的聚集等因素[4]。膽固醇的過量攝入是膽結石的首要前提，因此，通過飲食來誘導小鼠膽固醇結石是常用的造模方法之一。致石飼料的主體部分和常規飼料基本一致，除了滿足小鼠需要的蛋白質、碳水化合物、維生素、礦物質等營養物質之外，更重要的是，致石飼料還需額外考慮設計不同的造模因子組合來誘導小鼠膽固醇結石的發生，如高比例膽固醇、油脂、膽酸的使用等。

1964年，有研究者率先發現了在小鼠飼料中添加膽固醇和膽酸的組合可以有效建立小鼠膽結石模型。他們給小鼠喂養含有膽固醇和膽酸的致石飼料后，發現從膽石中提取出來的甾醇基本上是膽固醇，占了結石總重量的94%，而單獨喂養1%膽固醇2～8個月卻不能誘發出膽結石，以此推測膽酸在小鼠膽結石模型建立中必不可少，是促進膽石形成的重要條件[6]。隨后，研究者在致石飼料中設計高脂肪、高膽固醇和一定比例的膽酸誘導小鼠膽固醇結石的發生，結果在誘導8周后小鼠都能不同程度成模[27,32-33]。

因此，根據上述研究者的經驗，在目前致石飼料的設計和應用中，脂肪的用量一般為15%～30%，通常為豬油或者黃油等高飽和脂肪，膽固醇的使用劑量為1%～1.25%，而膽酸的用量則穩定在0.5%(表3)。

表3 不同造模因子設計對小鼠膽結石造模的影響

小鼠膽結石模型的建立為研究同源人類結石基因和探索人類膽石形成機制以及對癥治療奠定了良好的研究基礎。膽結石與很多消化內科病或其他疾病有著密切的關聯，小鼠膽結石模型的建立對研究腸道菌群的變化、高血脂、高胰島素血癥、非酒精性脂肪肝、肥胖、糖尿病、衰老以及不運動的生活方式帶來的疾病等方面都有著重要的意義。因此，致石飼料的研制與應用，作為膽結石研究的上游工作，顯得尤為重要。合理的造模因子設計，穩定安全的飼料原料品質，合適的實驗動物品系選擇，是膽固醇結石模型成功建立的最重要因素。