基于數據挖掘的PFKFB4在宮頸癌中的表達和基因調控網絡研究

古彩茹，劉威，林夢園

1.廣州市紅十字會醫院&暨南大學附屬廣州紅十字會醫院婦科，廣東 廣州 510220；2.廣州市紅十字會醫院&暨南大學附屬廣州紅十字會醫院乳腺科，廣東 廣州 510220；3.深圳市人民醫院婦科，廣東 深圳 518020

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在女性癌癥患者中的發病率和死亡率均占第四位[1]。盡管早期篩查可降低宮頸癌患者的死亡率，但宮頸癌的浸潤和轉移仍然是死亡的主要原因[2]，也是影響患者生存率的主要因素[3]。針對這種惡性腫瘤，目前仍需更多分子標記物用于精準診斷和預后判斷。因此，尋找宮頸癌早期診斷及預后判定新的生物標志物具有重要的臨床價值。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases 4，PFKFB4)與癌細胞的代謝異常密切相關。有報道稱，雙功能酶PFKFB4在多種類型的癌癥中高度表達，并且在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中已證明其對腫瘤存活的重要作用[4-8]。但目前關于PFKFB4蛋白與宮頸癌的相關報道較少。本文選取PFKFB4基因作為研究目標，通過生物信息學數據庫全面分析PFKFB4基因在宮頸癌中的表達和相關基因調控網絡，為進一步研究PFKFB4在宮頸癌中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 Linked Omics分析 Linked Omics數據庫(http://www.linkedomics.org/login.php)是一個基于網頁的平臺，可用于分析32個與TCGA癌癥相關的多維數據集[9]。本研究通過Linked Omics研究TCGA數據庫宮頸癌組織中的PFKFB4表達與患者腫瘤大小(T分期)、淋巴結轉移(N分期)、遠處轉移(M分期)、年齡、種族和預后(總生存，overall survival，OS)等臨床病理特征和預后的關系。利用Link Finder模塊分析TCGA數據庫宮頸癌隊列中與PFKFB4相關的差異表達基因，根據Pearson相關系數分析在宮頸癌中與PFKFB4顯著表達相關的基因，結果以火山圖和熱圖顯示。利用Link Finder模塊Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)對差異相關基因進行GO[細胞成分(cellular component，CC)，生物過程(biological process，BP)和分子功能(molecular function，MF)]分析，KEGG信號通路分析激酶靶標富集，miRNA靶標富集和轉錄因子靶標富集。

1.2 c-BioPortal分析 cBioPortal是一種開放獲取的網絡分析數據資源，可用于多種癌癥的基因組學數據的綜合性探索，可用于探索基因的突變，拷貝數變異(CNV)和mRNA表達情況[10]。本研究使用c-Bio-Portal分析TCGA數據庫中275例宮頸癌標本的PFKFB4基因變異頻率和類型。

1.3 Gene MANIA分析 Gene MANIA在線數據庫(http://www.genemania.org)是一個可用于構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)的網絡平臺，該平臺可以根據基因組學和蛋白質組學數據進行識別和擴展指定基因功能相似的基因列表[11]。Gene MANIA還可以根據每個所選查詢數據集的預測值進行權重評估。本研究采用Gene MANIA平臺探討PFKFB4可能存在相互作用的基因網絡。

2 結果

2.1 宮頸癌中PFKFB4的表達與臨床病理特征的關系 結果顯示，PFKFB4的表達與宮頸癌的T分期、N分期和M分期顯著相關(圖1)。T期高(P<0.001)、有淋巴結轉移(N1)(P=0.042)、伴有遠處轉移(M1)(P=0.047)者PFKFB4表達量高(圖1A~1C)。PFKFB4在西班牙裔人群的宮頸癌組織中表達量顯著高于非西班牙裔人群(P=0.047)，見圖1D。PFKFB4在宮頸癌中的表達量還隨著年齡的增高而逐漸增高(r=0.199，P<0.001)，見圖1E。最后，PFKFB4的表達水平顯著影響患者的OS，PFKFB4高表達組患者的中位生存時間為137.9個月，而低表達組的中位生存時間為110.3個月，PFKFB4高表達者的預后顯著差于低表達患者(P=0.002)，見圖1F。

圖1 在宮頸癌中PFKFB4的表達與臨床病理特征及預后的關系

2.2 宮頸癌中PFKFB4的相關性表達 為明確PFKFB4的潛在調控網絡，通過Person相關性分析探討與PFKFB4表達顯著相關的基因(圖1A)，結果提示PPFIA4、PDK1、P4HA1、SLC2A1、VEGFA是呈正相關差異最明顯的前5個基因(圖2B)，而SELP、ISCU、PLA1A、PGR和ALDH1A2是呈負相關差異最顯著的前5個基因(圖2C)。

圖2 在宮頸癌中與PFKFB4相關的差異表達基因(Linked Omics)

2.3 宮頸癌中與PFKFB4表達相關的激酶、miRNA和轉錄因子網絡 為進一步探索PFKFB4中PFKFB4的相關調控網絡，通過GSEA分析發現多個與PFKFB4統計學相關的激酶、miRNA和轉錄因子。與PFKFB4表達相關最顯著的前五個激酶分別是淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶LCK(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK)、蛋白激酶N2(PKN2)、檢查點蛋白激酶1(CHEK1)、激酶IJK和激酶MA2PK1。與PFKFB4表達相關最顯著的前五個miRNA分別是miR-200a、miR-450、miR-18a、miR-423和miR-383。與PFKFB4相關最顯著的前五個轉錄因子分別是HIF1、NFE2、ROAZ、AP1和MYOGNF1，見表1。

表1 宮頸癌中的激酶、miRNAs和轉錄因子靶向網絡

2.4 GO功能注釋和KEGG信號通路分析 在Linked Omics數據分析平臺，對PFKFB4及其在宮頸癌中顯著表達的相關基因進行基因富集分析(GESA)，其富集的生物學功能主要體現在蛋白結合、離子結合、核酸結合、水解酶活動、轉移酶活動等(圖3A)。通過KEGG信號通路富集分析發現，PFKFB4及顯著相關基因在宮頸癌中主要參與了缺氧誘導因子HIF1信號通路，糖酵解/糖再生信號通路，果糖和甘露糖代謝通路等(圖3B)。

2.5 宮頸癌中PFKFB4的基因組改變 通過cBioPortal分析TCGA數據庫中275例宮頸癌的突變頻率和類型，結果顯示275名宮頸癌患者中只有1.8%的患者的PFKFB4發生了改變(圖4)。這些改變包括：mRNA上調4例(1.45%)和突變1例(0.36%)。由此可見，在宮頸癌中，PFKFB4的基因突變發生率非常低。

2.6 PFKFB4的PPI蛋白互作網絡 通過Gene-MANIA分析PFKFB4的PPI蛋白互作網絡，結果提示PFKFB4與低氧誘導因子1α(HIF1A)，己糖激酶2(HK2)，6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶1/2/3(PFKFB1/2/3)，磷酸甘油酸變位酶1/2/4/5，賴氨酸羥化酶1(PLOD1)，線粒體融合蛋白(MFN1)等存在相互作用(圖5)。

圖5 PFKFB4的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡和功能分析

3 討論

宮頸癌的治療主要以手術、化療和放療為主，但是上述治療之后仍存在復發和轉移可能。目前，臨床上迫切需要開發更多分子標記物用于宮頸癌的精準診斷和預后判斷。癌細胞即使在氧氣充足的情況下仍然通過糖酵解來代謝葡萄糖為其供能，靶向腫瘤的糖酵解被認為是一個潛在的治療策略[12-13]。雙功能酶PFKFB4是一個糖酵解的關鍵酶，大量研究提示PFKFB4與腫瘤的惡性進展密切相關[5，8，14-16]。但是，PFKFB4在宮頸癌中是否能作為預后判斷的分子標記物尚不清楚。為了更深入地了解PFKFB4在宮頸癌中診斷和預后判斷方面的價值，通過對公共測序數據進行生物信息學分析，研究PFKFB4的表達與宮頸癌臨床病理特征及預后的關系，并探討PFKFB4在宮頸癌中的相關調控網絡。這項研究為PFKFB4在宮頸癌進展中的重要性及其作為宮頸癌潛在預后標志物提供了多層次的證據。研究結果表明PFKFB4的過表達對宮頸癌的生長侵襲、遠處轉移和患者生存結局中具有顯著的影響。PFKFB4在宮頸癌中與幾種腫瘤相關激酶(例如MK2PK1)、miRNA(例如miRNA-200a)和轉錄因子(例如HIF1)顯著相關。這項研究基于生物信息學挖掘公共數據庫中的宮頸癌測序數據，為后續研究PFKFB4在宮頸癌中的功能和機制奠定了初步基礎。

本研究首先對PFKFB4在宮頸癌組織中表達與患者臨床的病理特征進行了分析，發現PFKFB4的表達與患者更晚的TNM分期密切相關。PFKFB4在腫瘤越大的患者中表達量明顯高于腫瘤較小的患者，在有淋巴結轉移或遠處轉移的宮頸癌患者組織中的表達也顯著高于無淋巴結轉移或無遠處轉移的患者，這就提示PFKFB4與宮頸癌更具有侵襲性的臨床病理特征是明確相關的，PFKFB4很有可能促進宮頸癌的進展。其次，PFKFB4的表達與患者的年齡相關，隨著患者的年齡增長，PFKFB4的表達量也有升高趨勢。另外，生存分析進一步明確PFKFB4的表達與患者的OS的關系，結果發現PFKFB4高表達的患者預后顯著差于低表達的患者。這就表明PFKFB4可以作為宮頸癌的預后標記物，但是，仍需要多中心的研究進一步證實。

考慮到PFKFB4與患者預后的顯著相關性，PFKFB4可能對宮頸癌的惡性進展發揮重要調控作用。本研究進一步探討與PFKFB4在表達上存在統計學相關的基因。相關性分析提示PFKFB4與一些癌基因的表達呈正相關，比如影響癌癥的增殖、侵襲、轉移的關鍵調控因子丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)[17-18]，參與腫瘤血管形成促進腫瘤進展的血管內皮生長因子A(VEGFA)[19-20]，多種腫瘤的潛在標記物和治療靶點脯氨酸-4-羥化酶α多肽Ⅰ(P4HA1)[21-22]等。這些結果進一步提示PFKFB4可能通過與其他癌基因相互作用共同促進宮頸癌的惡性進展。

本研究使用GSEA對PFKFB4進行富集分析獲得了與其存在顯著關聯的多個激酶，miRNA和轉錄因子。結果表明，PFKFB4的功能網絡主要參與代謝、生物調節、對刺激的反應和細胞增殖等。發現宮頸癌中的PFKFB4與包括MAP2K1、CHEK1和LCK在內的激酶網絡相關。這些激酶可參與調節有絲分裂、DNA損傷和細胞內信號傳導，這些通路異常與腫瘤的進展關系非常密切。此外，本研究還鑒定了幾種與PFKFB4相關的miRNA。這些小RNA，可參與基因表達的轉錄后調控，進而影響腫瘤的進展。亦有其他研究證實miR-200a、miR-18a和miR-383可用作宮頸癌的診斷和預后標志物[23-25]。

這項研究使用基于生物信息學的在線工具對來自TCGA數據庫的宮頸癌的組學數據進行靶基因分析，揭示了PFKFB4的潛在調控網絡信息，為進一步研究PFKFB4在宮頸癌中的作用奠定基礎。與傳統的芯片篩選相比，該方法具有樣本量大、成本低、操作簡便的優點。這也使得大規模的宮頸癌的基因組學研究和后續功能研究成為可能。但是，本研究基于數據挖掘的分析結果仍需要得到更多的檢測進行驗證，包括功能檢測和分子機制的研究，才能進一步明確PFKFB4在宮頸癌的調控作用。