硫化氫對血管性癡呆大鼠缺血再灌注損傷中NLRP3表達的影響

章亞明 田茂 鄭菊 肖雁

(1貴州醫(yī)科大學分子生物學重點實驗室 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004；貴州醫(yī)科大學 2附屬醫(yī)院；3附屬白云醫(yī)院)

血管性癡呆(VaD)被認為是出血性腦卒中、缺血性腦卒中和造成記憶、認知和行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征〔1〕。VaD發(fā)病機制目前尚不明確，研究〔2,3〕表明，炎癥在VaD發(fā)病過程中起到關鍵作用，炎癥相關因子直接參與VaD的發(fā)生發(fā)展。腦缺血缺氧可誘發(fā)急性或慢性炎癥，而急、慢性炎癥又可反過來加速繼發(fā)性腦損傷進展，逐漸影響認知功能，最終導致VaD。炎癥小體是一種多蛋白復合物，能夠激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1的表達，進而調(diào)節(jié)白細胞介素(IL)-1β、IL-18等促炎細胞因子的成熟和分泌。這些細胞因子在促進先天性免疫反應和炎癥中起著關鍵作用。在各種炎癥復合物中，含有NOD樣受體NLR家族pyrin結構域(NLRP)3是最具特征的，NLRP3在包括創(chuàng)傷性腦損傷在內(nèi)的各種腦疾病中起著至關重要的作用〔4,5〕。近年來有學者證實外源性的硫化氫(H2S)可抑制人肝細胞中NLRP3炎癥小體的表達，從而減輕炎癥反應〔6〕。同時也有學者證實〔7〕，H2S對脂多糖造成的炎癥性急性肺損傷大鼠具有一定的保護作用。課題組前期的研究也證實給予大劑量(100 μmol/kg)的硫氫化鈉(NaHS)預處理能夠有效緩解大鼠神經(jīng)元細胞缺血再灌注后的形態(tài)〔8〕。本文旨在探索H2S和NLRP3炎癥小體在大鼠慢性低灌注損傷模型中所扮演的角色及可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠50只，雄性，體重220～250 g，購自貴州醫(yī)科大學動物實驗中心〔合同號為：SCKY(黔)2018-0001〕。

1.2試劑 NaHS、二甲基對苯二胺鹽酸鹽、多聚甲醛、水合氯醛、三氯醋酸、三氯化鐵、醋酸鋅購于美國Sigma公司；NLRP3、Caspase-1抗體購自美國AdipoGEN公司，β-actin抗體購自美國Abcam公司，電化學發(fā)光(ECL)-Plus液購于美國Thermo Fisher Scientific公司，血清IL-1β、IL-18檢測試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司，NLRP3抑制劑(CY-09)購自美國MedChemexpress(MCE)公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購于美國Millipore公司，組織蛋白提取試劑盒購自碧云天生物公司。

1.3儀器 DMS2-Morris水迷宮購于中國醫(yī)學科學院、ELX800UV酶標儀購于美國Bio-Tec公司、Varioskan LUX多通道酶標儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司、GeneGnome XRQ化學發(fā)光成像儀購于英國SYNGENE公司、Western印跡跑膠裝置電源北京百晶科技公司、離心機購于湖南湘儀有限公司、電熱恒溫水浴鍋購于光明醫(yī)療儀器廠。

1.4實驗動物篩選及分組 大鼠標準適應性喂養(yǎng)1 w后，進行Morris水迷宮空間探索實驗和定向航行實驗〔9～12〕，前4 d進行定向航行試驗，方法為：每日按Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ象限順序，將大鼠從各象限入水點面對池壁入水，記錄1 min內(nèi)大鼠從入水到爬上固定于第Ⅳ象限平臺所需時間為逃避潛伏期。第5天進行空間探索實驗，方法為：撤去平臺，記錄1 min內(nèi)SD大鼠第1次穿過原站臺的時間及穿過的總次數(shù)。最終選取了記憶力和學習能力相近的24只SD大鼠，隨機分為4組，每組6只，分別為假手術組、模型組、抑制劑組(CY-09組)、NaHS組(NaHS 100 μmol/kg)。

1.5大鼠IRI模型制備 大鼠術前禁食12 h，禁水4 h，稱重計算水合氯醛(350 mg/kg)的用量，成功麻醉后固定，備皮，75%乙醇和碘伏消毒，沿背側頸正中切開，剝離皮下組織使雙側第一頸椎橫突翼小孔暴露，使用直徑0.5 mm 電凝針凝閉雙側椎動脈，局部傷口縫合前，涂抹適量青霉素粉防止感染，縫合皮膚。24 h 后行頸前正中切口，暴露雙側頸動脈，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，夾閉3次，每次5 min，間隔1 h〔13〕。假手術組只分離頸總動脈和椎動脈，不進行頸總動脈夾閉和椎動脈凝閉。抑制劑組術前30 d開始腹腔注射5 mg/kg CY-09，造模成功后繼續(xù)腹腔注射30 d，NaHS組術前30 d開始腹腔注射100 μmol/kg NaHS，造模成功后繼續(xù)腹腔注射30 d。

1.6行為學實驗 造模30 d后檢測模型大鼠的學習記憶能力，進行Morris水迷宮空間探索實驗和定向航行實驗，方法同前。

1.7組織樣本的制備 行為學實驗結束后進行組織樣本的制備。腹腔注射水合氯醛麻醉后，迅速取腦、取血。取大腦置于4%的多聚甲醛中浸泡24 h以上，備用。取2 ml股動脈血液于采血管中，迅速離心，分離出血清，-80℃凍存待檢。

1.8蘇木素-伊紅(HE)染色 將大鼠腦組織切片進行HE染色，顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元細胞。

1.9大鼠血清H2S濃度測定 用亞甲基藍法〔14，15〕檢測大鼠血清中的H2S的含量，預先在2.0 ml的EP管中加入15 μl的醋酸鋅(1%)，然后加入大鼠血清100 μl，混勻，依次加入30 μl三氯醋酸(10%)、20 μl二甲基對苯胺鹽酸鹽(20 mmol/L)、20 μl三氯化鐵(30 mmol/L)，用振蕩器震蕩10 s，置于37℃水浴箱中避光孵育10 min，6 000 r/min 離心10 min，取上清液180 μl檢測吸光度值，根據(jù)H2S標準曲線計算出濃度〔Y=111.64X-2.429 8(R2=0.999 7)〕。

1.10大鼠血清IL-1β、IL-18含量測定 采用北京百奧萊博科技有限公司酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒進行。

1.11海馬組織蛋白NLRP3、Caspase-1含量測定 采用Western印跡測定各組海馬組織中NLRP3、Caspase-1表達量。

1.12統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析或非參數(shù)檢驗。

2 結 果

2.1行為學實驗 與假手術組相比，模型組逃避潛伏期所需時間顯著延長(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，CY-09組和NaHS組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組定向航行實驗、空間探索實驗及血清H2S、IL-1β、IL-18含量及NLRP3、Caspase-1比較

2.2海馬組織HE染色 在顯微鏡油鏡下觀察，假手術組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞結構完整清晰，層次分明，排列緊密，層層疊加，細胞核染色較淺，胞質(zhì)豐富，形態(tài)較完整。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元細胞輪廓模糊，邊界不清，神經(jīng)元細胞層次明顯減少，數(shù)量也明顯減少，呈松散排列，細胞核發(fā)生固縮，染色深，有碎片出現(xiàn)。CY-09組大鼠海馬較模型組明顯輪廓清晰，神經(jīng)元細胞數(shù)增多，細胞層次增多，細胞排列較緊密，僅尖部存在少量固縮細胞核。NaHS組大鼠海馬較模型組明顯輪廓清晰，排列較緊密，層次豐富，細胞數(shù)明顯多于模型組，神經(jīng)元細胞完整，胞質(zhì)豐富，胞排列緊密，出現(xiàn)少量變形細胞。見圖1。

圖1 各組海馬組織(HE染色，×100)

2.3血清H2S濃度水平比較 模型組血清H2S濃度低于假手術組、NaHS組及抑制劑組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CY-09組與假手術組相比無統(tǒng)計學差異，表明加入NLRP3小體抑制劑并沒有使血清H2S濃度提升；NaHS組H2S濃度明顯高于假手術組(P<0.05)。見表1。

2.4大鼠血清細胞因子變化情況 與模型組相比，CY-09組、NaHS組及假手術組血清IL-1β、IL-18濃度明顯減低(P<0.05)。見表1。

2.5海馬組織中NLRP3、Caspase-1蛋白的表達情況 模型組海馬組織NLRP3、Caspase-1表達水平較假手術組明顯升高(P<0.05)；經(jīng)CY-09抑制劑處理的NLRP3蛋白水平明顯低于模型組，同時Caspase-1表達也減低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NaHS組中NLRP3、Caspase-1表達水平較模型組也明顯降低(P<0.05)。見表1、圖2。

1～4:假手術組、模型組、CY-09組、NaHS組

3 討 論

H2S是一種內(nèi)源性氣體信號分子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學效應。近年來，研究證實H2S對缺血再灌注引發(fā)的組織器官具有很好的保護作用〔16,17〕。本課題組也探討了H2S對VaD保護作用的部分機制，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激〔18〕，線粒體自噬〔19〕，神經(jīng)元細胞自噬〔13〕。本研究結果說明抑制NLRP3不會使H2S濃度升高，NLRP3小體介導的炎癥反應參與了損傷的形成，但不是其唯一的發(fā)病因素，抑制NLRP3生成不能使血清中H2S濃度升高。

本研究提示NLRP3與大鼠缺血再灌注損傷正相關，抑制NLRP3生成可以減輕大鼠IRI，NLRP3參與IRI生理過程，IRI可以引起NLRP3表達增加，H2S能降低大鼠IRI過程中NLRP3的表達。

H2S對VaD的保護作用的機制十分復雜，涉及面廣，炎癥小體NLRP3在其中是如何發(fā)揮作用的，其具體的信號通路怎樣，都有待進一步的探究。本研究僅進行了動物模型實驗，并沒有體外細胞實驗的支撐，需要后續(xù)的更多研究來探討NLRP3在H2S保護VaD中的作用。